Получение различных популяций нервных клеток из гиппокампа крысы

Возьмите перфузированные фрагменты гиппокампа крысы.

Инкубируйте с папаином, чтобы переварить внеклеточный матрикс ткани и разрыхлить клетки, включая нейроны, астроциты и микроглию.

Добавьте DNase и перемешайте.

Механически диссоциируйте ткань с помощью пипеток прогрессивно уменьшающегося диаметра для получения одноклеточной суспензии. Инкубируйте ДНКазу, чтобы разрушить загрязняющую ДНК.

Пропустите суспензию через сетчатый фильтр, удаляя мусор.

Добавьте буфер, содержащий двухвалентные ионы, чтобы остановить ферментативную активность.

Центрифугируйте и удалите богатую ферментами надосадочную жидкость.

Теперь добавьте буфер и антимиелиновые магнитные шарики. Инкубируйте бусины, чтобы связать остатки миелина.

После инкубации центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте смесь в буфере и загрузите ее на магнитную разделительную колонну, содержащую ферромагнитные сферы, помещенные в магнитное поле магнитного сортировщика.

Магнитное поле удерживает связанный с магнитными шариками миелиновый мусор в колонке, в то время как клетки, свободные от миелина, проходят через него.

Промойте колонку буфером и соберите проточные каналы, содержащие нейроны, астроциты и микроглию.

Начните нейронную диссоциацию с помощью стерильных бритвенных лезвий, чтобы нарезать кубиками каждый образец, собранный из тканей мозга взрослого человека, на небольшие кусочки весом от 30 до 400 миллиграммов на крышке шестилуночного планшета для культивирования. Затем погрузите ткань в 1 миллилитр HBSS, не содержащего кальция и магния, и с помощью пипетки перенесите образцы в стерильные 2-миллилитровые центрифужные пробирки.

Когда все ткани будут собраны, центрифугируйте образцы и аспирируйте надосадочную жидкость, а затем инкубируйте образцы в течение 15 минут на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия, переворачивая трубку несколько раз каждые пять минут, чтобы снова суспендировать осевшие кусочки ткани.

В конце инкубации добавьте 30 микролитров свежеприготовленной пробирки с ферментами к каждому образцу и аккуратно переверните пробирки. Затем с помощью пастеровской пипетки с маркировкой 1 диссоциируйте каждый образец с помощью 30 растирания вверх и вниз, стараясь не образовывать пузырьки. Инкубируйте образцы в течение еще 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия с инверсией каждые пять минут, с последующей диссоциацией образцов с помощью пипетки Пастера No 2, как показано выше.

Затем, переключитесь на пипетку No3. Повторите диссоциацию и инкубируйте образцы еще 10 минут на водяной бане, с инверсией каждые пять минут. В конце инкубации отфильтруйте одноклеточные суспензии через 80-микронные клеточные фильтры в 15-миллилитровые пробирки Falcon, промыв каждый фильтр 10 миллилитрами HBSS, не содержащими кальция и магния, чтобы остановить ферментативные реакции. Когда последний образец будет отфильтрован, вращайте пробирки вниз и аспирируйте надосадочную жидкость.

Чтобы истощить миелин из клеточных суспензий, тщательно суспендируйте гранулы в 400 микролитрах буфера для удаления миелина и добавьте соответствующее количество гранул для удаления миелина в каждую пробирку. Пипеткой подавайте растворы вверх и вниз до тех пор, пока ячейки и шарики полностью не перемешаются. Затем инкубируйте образец при температуре 4 градуса Цельсия в течение 15 минут. После инкубации промойте каждый образец в 5 миллилитрах буфера для удаления миелина.

Пока ячейки вращаются, поместите по одной колонке для каждого образца в магнитное поле магнитного сортировщика и поместите чистый фильтр 80 микрон поверх каждой колонки. Промойте каждый фильтр и колонку 1 миллилитром буфера для удаления миелина три раза, собирая весь проточный материал в контейнер для отходов.

После окончательного промывки поместите 5-миллилитровые полистирольные трубки с круглым дном непосредственно под каждую колонну, чтобы собрать элюат. Затем аспирируйте надосадочную жидкость из образцов и повторно суспендируйте гранулы в 500 микролитрах буфера для удаления миелина.

Сразу же нанесите клеточные суспензии на колонки, собрав клетки в расположенные ниже пробирки. Затем промойте каждый фильтр и колонку 4 раза 1 миллилитром буфера для удаления миелина на одну стирку. После последнего промывания раскрутите клетки вниз и аспирируйте надосадочную жидкость.