Выделение нейронов из Caenorhabditis elegans с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией

Возьмите суспензию клеток, полученных от трансгенных червей Caenorhabditis elegans в культуральной среде.

Суспензия содержит клетки из различных тканей, в том числе нейроны из нервной системы.

Трансгенные черви были сконструированы для экспрессии флуоресцентного белка, конъюгированного с везикулярным трансмембранным транспортером. Этот транспортер, присутствующий на синаптических везикулах, несущих нейромедиатор ацетилхолин, обнаруживается в холинергических нейронах по всему телу.

Центрифугируйте клеточную суспензию и выбросьте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в свежей питательной среде для флуоресцентно-активируемой сортировки клеток, или FACS.

Проанализируйте клеточную суспензию с помощью FACS. Флуоресцентно меченые холинергические нейроны излучают флуоресценцию при воздействии света соответствующей длины волны, отделяя их от других немеченых клеток.

Перенесите выделенные нейроны в многолуночную пластину. Инкубируйте клетки во увлажненной камере для поддержания уровня влажности.

Центрифугируйте клетки из изолированной клеточной суспензии при 10 000 g и при 4 градусах Цельсия в течение 5 минут. Отбраковать надосадочную жидкость и ресуспендировать гранулированные клетки в среде, дополненной L-15, до плотности клеток не более 6 миллионов клеток/миллилитр, чтобы избежать перегрузки проточного цитометра. Затем отсортируйте клетки по GFP-положительной экспрессии с помощью проточного цитометра, способного сортировать образцы.

GFP-отрицательные клетки могут быть использованы в качестве контроля для анализа, не зависящего от типа клеток. После этого поместите изолированные клетки в лунки стерильного шестилуночного планшета. Поместите тарелку в пластиковый контейнер. Добавьте влажную салфетку или мягкую папиросную бумагу, чтобы добавить влаги в клетки, и инкубируйте при температуре 20 градусов Цельсия.