Получение срезов мозжечка из эмбрионального мозга цыпленка

Возьмите оплодотворенное куриное яйцо на подходящей стадии развития.

Разрежьте скорлупу, чтобы получить доступ к эмбриону.

Найдите и препарируйте голову, затем перенесите ее в чашку Петри, содержащую охлажденный фосфатный буфер.

Удалите глаза и челюсти.

Отделите кожу от поверхности черепа.

Далее разрежьте и удалите кости черепа.

Очистите окружающую соединительную ткань, чтобы обнажить мозг.

Отделите передний мозг.

Затем отделите мозжечок от заднего мозга и кровеносного сосуда.

Переложите мозжечок в охлажденный солевой буфер.

Эмбриональный мозжечок содержит слой быстро делящихся нейронных клеток-предшественников, что делает его ценным для исследований нейрогенеза.

Поместите мозжечок на платформу измельчителя для салфеток.

Удалите лишний буфер и нарежьте мозжечок.

На ломтики выложите охлажденную соль в буфер

Переложите ломтики мозжечка в чашку Петри, содержащую охлажденный буфер соли.

Под микроскопом отделите отдельные срезы для дальнейшего анализа.

Для начала поместите оплодотворенные коричневые куриные яйца в инкубатор для яиц при температуре 38 градусов Цельсия, пока они не достигнут эмбрионального 14-го дня. На 14-й день эмбриона вырежьте отверстие в яйце, чтобы обнажить эмбрион, и обезглавьте эмбрион цыпленка в яйце. Поместите голову в чашку Петри, содержащую ледяной PBS.

Под рассекающим микроскопом с помощью стандартных щипцов сделайте разрез за каждым глазом, по всей ткани, удаляя глаза и верхнюю челюсть. Затем сделайте второй разрез по всей глотке, чтобы удалить нижнюю челюсть. Затем с помощью стандартных щипцов удалите кожу с поверхности черепа, отшелушивая ее. Затем удалите лобную и теменную кости, обнажив мозг.

С вентральной стороны удалите глоточный хрящ и вспомогательную мезенхиму. Затем поместите мозг тыльной стороной вверх и осторожно удалите мезенхиму, дорсально к заднему мозгу, стараясь не повредить пиа. Затем сделайте разрез по всей ткани между средним и задним мозгами, чтобы отделить задний мозг, включая мозжечок. Сделайте разрезы по всей ткани как на боковых стыках мозжечка, так и на крыльевой пластине заднего мозга. Удалите весь мозжечок, заботясь о сохранении целостности пиа на протяжении всего вскрытия.

Наконец, удалите формирующееся сосудистое сплетение и переместите рассеченный мозжечок в ледяной HBSS. Перенесите весь мозжечок на стерильную платформу измельчителя тканей, используя шпатель или 3-миллилитровую пипетку Пастера с отрезанным кончиком, чтобы расширить отверстие. Удалите лишнюю жидкость с помощью пипетки.

Установите скорость резки измельчителя бумаги на 50% от ее максимального значения. Затем разрежьте мозжечок в необходимой ориентации на толщину 300 микрометров. С помощью 3-миллилитровой пастеровской пипетки накройте нарезанный мозжечок холодным HBSS.

Затем переложите HBSS и ломтики в 60-миллиметровую чашку Петри, содержащую 20 миллилитров ледяного HBSS, используя 3-миллилитровую пастеровскую пипетку с разрезанным кончиком. Поместите чашку Петри под препарирующий микроскоп, освещенный оптоволоконным источником света. Затем с помощью часовых щипцов отделите отдельные срезы мозговой ткани.