Создание первичных смешанных культур глиальных клеток из спинного мозга мыши

Соберите спинной мозг мыши и разрежьте его на фрагменты.

Перенесите фрагменты в пробирку, содержащую протеолитический фермент и ДНКазу. Вихревая и инкубируйте.

Фермент переваривает внеклеточный матрикс ткани, в то время как ДНКаза разлагается, загрязняя свободную ДНК.

Вортекс снова и пипетка многократно до полной диссоциации тканей, получая одноклеточную суспензию.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в растворе, содержащем ДНКазу и ингибитор протеазы, и вортекс. Ингибитор нейтрализует фермент.

Сверху налейте свежий раствор ингибитора, центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.

Повторно суспендируйте клетки в среде с градиентом плотности, вихре, а затем центрифугируйте.

Клетки оседают внизу, в то время как миелиновые остатки остаются наверху.

Выбросьте мусор. Повторно промойте буфером, центрифугой и удалите надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в питательной среде.

Наложите пластины на клетки. Непокрытая поверхность облегчает прикрепление глиальных клеток.

Удалите отработанную среду и добавьте свежую среду, чтобы вызвать пролиферацию глиальных клеток, создавая смешанную глиальную культуру.

Работая в капюшоне для культуры тканей, перенесите четыре спинных мозга мыши в чашку Петри HBSS. С помощью стерильных ножниц и щипцов разрежьте каждый из спинных мозгов на мелкие кусочки. Затем переложите кусочки в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую смесь ферментов папаин-ДНКазы. Избегайте переноса HBSS в смесь ферментов, так как это может привести к снижению производительности фермента.

Крайне важно, чтобы кусочки ткани хорошо переваривались для получения одноклеточной суспензии. Однако чрезмерное переваривание приведет к уменьшению количества жизнеспособных клеток. Каждая лаборатория должна провести пилотные тесты, чтобы определить точное время переваривания на основе того, что лучше всего подходит для их клеток.

Затем осторожно сделайте трубку вихревой, а затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа с орбитальной тряской со скоростью 150 оборотов в минуту. После инкубации сделайте трубку вихревыми, а затем энергично растирайте ткань с помощью пипетки объемом 5 миллилитров, чтобы способствовать дальнейшей диссоциации. Затем переложите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку и центрифугируйте при 300-кратном g в течение 5 минут при комнатной температуре.

Во время центрифугирования добавьте 300 микролитров восстановленного раствора ингибитора овомукоида альбумина к 2,7 миллилитров EBSS в стерильной пробирке и хорошо перемешайте. Затем добавьте 150 микролитров раствора ДНКазы. После центрифугирования удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клеточную гранулу в свежеприготовленном ингибиторе овомукоидов альбумина и растворе ДНКазы. Вихревой колодец разбить ячейку с пеллетой.

Затем добавьте в клеточную суспензию 3 миллилитра восстановленного раствора ингибитора овомукоида альбумина без ДНКазы. Центрифугируйте клетки при 70-кратном g в течение 6 минут при комнатной температуре. После отжима удалите надосадочную жидкость, которая содержит фрагменты мембраны, и сохраните гранулы.

Чтобы удалить миелин из диссоциированных клеток спинного мозга, сначала добавьте 8 миллилитров среды с градиентом плотности 20% комнатной температуры в трубку, содержащую клеточную гранулу, и осторожно перемешайте. Далее центрифугируйте ячейки при 800 умноженных на g в течение 30 минут при комнатной температуре без поломки. После центрифугирования тщательно отсасывайте верхний слой мусора, который содержит в основном миелин, и надосадочную жидкость, выходящую из гранулы.

Чтобы удалить оставшийся градиент плотности, промойте ячейки, повторно суспензировав гранулу 8 миллилитрами cDMEM, разведенными HBSS. Центрифугируйте клетки при 400 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия. Удалите надосадочную жидкость и промойте клетки разведенным cDMEM, как и раньше.

После удаления надосадочной жидкости гранулу можно хранить на льду до засеивания клеток. Когда все будет готово к покрытию, повторно суспендируйте клетки в 14 миллилитрах cDMEM с добавлением 2-меркаптоэтанола и добавьте 1 миллилитр клеточной суспензии в каждую лунку в 12-луночном планшете.

Планшеты с дополнительными лунками, которые можно использовать для определения среднего количества клеток в лунке и содержания микроглии в культуре. После того, как клетки будут покрыты, инкубируйте их при температуре 35,9 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. Смените носитель на 1-й день, то есть на следующий день после нанесения покрытия.

Некоторые клетки прикрепляются к культуральной пластине, но они все же в основном круглые. Также имеется много плавающих ячеек и значительных обломков. Повторите смену носителя через три-четыре дня после этого.