Дифференцировка иммортализованных мультипотентных отических предшественников в спиральные ганглиозные нейроны и оценка дифференцировки

Возьмите многолуночный планшет, содержащий стерильные покровные стекла, покрытые субстратом для клеточных культур.

Введение иммортализованных мультипотентных отических предшественников, или iMOP, в среду дифференцировки нейронов.

iMOPs являются предшественниками различных клеток внутреннего уха, включая спиральные ганглиозные нейроны, или SGN, которые передают слуховую информацию в мозг.

Инкубируют, позволяя клеткам прилипнуть к субстрату. Среда индуцирует дифференцировку iMOP в SGN.

Добавьте фиксатор для индуцирования сшивки белков, сохраняя морфологию клеток, и детергентный раствор для проникновения в клеточные мембраны.

Введите блокирующий реагент для предотвращения неспецифической маркировки.

Добавьте флуорконъюгированные антитела, специфичные к маркерам дифференцировки нейронов, и инкубируйте, позволяя антителам помечать SGN.

Промойте для удаления несвязанных антител и закрепите покровные стекла с помощью монтажной среды, содержащей флуоресцентное ядерное пятно.

С помощью флуоресцентной микроскопии можно обнаружить сигналы антител, чтобы подтвердить дифференцировку iMOP в SGN.

Сначала очистите круглые стеклянные покровные стекла, поместив их в стерильную 100-миллиметровую пластину и погрузив в 70% этанол. Аккуратно перемешайте покровные листы, чтобы убедиться, что они накрыты, и оставьте блюдо при комнатной температуре на 10 минут. Затем промойте покровные стекла три раза в стерильной 1x PBS, а затем один раз стерильной водой.

Затем дайте покровным стеклам высохнуть, подвергнув их воздействию ультрафиолетового света в вытяжке для культуры тканей в течение 15 минут. Для немедленного использования поместите по одному стерильному покровному стеклу в каждую лунку 24-луночного планшета и осторожно встряхните планшет, чтобы убедиться, что все покровные стекла лежат ровно. Затем покройте покровные стекла, добавив 0,25 миллилитра 1x PBS, содержащего 10 микрограммов поли-D-лизина на миллилитр в каждую лунку.

После того, как планшет выдержал в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия, удалите раствор поли-D-лизина и трижды промойте лунки стерильным 1x PBS. После того, как жидкость из последней промывки будет аспирирована, введите 0,25 миллилитра 1x PBS, содержащего 10 микрограммов ламинина на миллилитр, в каждую из 24 лунок. После инкубации планшета в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия аспирируйте раствор ламинина. Затем промойте каждую лунку 1 миллилитром 1x PBS три раза, но оставьте PBS от последней промывки в лунках до тех пор, пока ячейки не будут готовы к нанесению на пластины.

Чтобы начать дифференцировку нейронов, подсчитайте клетки из диссоциированных отосфер, как описано ранее, а затем повторно суспендируйте их в предварительно нагретой среде для дифференцировки нейронов. Продолжайте засевать от 1 до 1,5 x 10⁵ ячеек iMOP в каждую лунку пластины, содержащей покрытые покровные стекла. Инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом, заменяя среду для дифференцировки нейронов через день.

Через семь дней отсадите среду и зафиксируйте клетки, которые следует прикрепить к покровным стеклам, добавив в каждую лунку по 4% формальдегида и оставив их на 15 минут при комнатной температуре. Затем удалите формальдегид и промойте клетки один раз в 1x PBS, содержащем 0,1% Triton X-100. Затем снимите промывочный буфер и добавьте в каждую лунку блокирующий буфер, состоящий из 1x PBS, содержащего 10% обычной козьей сыворотки и 0,1% Triton X-100.

Оставьте клетки на один час при комнатной температуре, а затем удалите жидкость и замените ее блокирующим буфером, содержащим соответствующее разведение антител Cdkn1b или Tubb3. После ночной инкубации при температуре 4 градуса Цельсия промойте клетки 1x PBS, содержащим 1% Triton X-100, а затем продолжайте иммуноокрашивание, как описано ранее. После того, как окрашивание будет завершено, выполните окончательную промывку, добавив в лунки 1x PBS.

Чтобы подготовить их к анализу, снимите покровные стекла, к которым прикреплены пятнающие элементы, с 24-луночного планшета и поместите их на монтажный материал на предметном стекле. Дав монтажному материалу высохнуть в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия, получите эпифлуоресцентные изображения, как описано ранее.