Культивирование ex vivo и визуализация глазодвигательных срезов трансгенных эмбрионов мышей

Возьмите трансгенную беременную мышь, хирургически изолируйте матку, содержащую эмбрионы, и промойте ее, чтобы удалить остатки крови.

Удалите эмбрионы, содержащие флуоресцентно меченые моторные нейроны, и перенесите их на крышку многолуночного планшета.

Добавьте расплавленную агарозу и охладите крышку, чтобы вызвать образование геля, внедряя эмбрионы.

Под флуоресцентным микроскопом выровняйте глазодвигательные ядра и глаза в линию и обрежьте агарозу параллельно линии.

Закрепите эмбрион на стадии образца и поместите его в вибратомную камеру, заполненную буфером для холодной нарезки.

С помощью вибратома сгенерируйте срезы, содержащие глазодвигательные ядра и глаза. Ядра образуют глазодвигательные нервы, которые контролируют движение глаз.

Переложите срезы на вкладыши для культур внутри многолуночной пластины, содержащей питательную среду, и инкубируйте.

Используя флуоресцентный микроскоп, делайте снимки через равные промежутки времени, чтобы наблюдать за флуоресцентно помеченными глазодвигательными нейронами, расширяющими аксоны к глазам.

Перед началом процедуры, во-первых, подтвердите беременность с помощью УЗИ на эмбриональный день 10,5 от запланированного периода случки. Соберите эмбрионы, опрыскайте брюшную полость беременной мыши 70% этанолом и с помощью ножниц откройте брюшную полость для извлечения матки. Промойте матку в чашке Петри с ледяным HBSS, прежде чем поместить орган во вторую чашку Петри со свежим ледяным HBSS.

Под микроскопом извлеките эмбрионы из рога матки и их отдельных амниотических мешочков, поместив каждый эмбрион на нижнюю сторону крышки 12-луночного планшета на льду по мере их сбора. Используйте фильтровальную бумагу, чтобы удалить любые жидкости, окружающие каждый эмбрион, не касаясь самих эмбрионов, и погрузите эмбрионы в жидкость с 4% легкоплавкой агарозой.

Поставьте крышку тарелки на лед, чтобы агароза застыла. Когда агароза застынет, переверните зародыши и накройте другую сторону каждого образца дополнительной агарозой. Когда второй объем агарозы застынет, используйте флуоресцентный препарирующий микроскоп, чтобы обрезать агарозу вокруг каждого эмбриона так, чтобы каждый эмбрион был правильно ориентирован на стадии вибратома.

Глазодвигательные ядра и ранние выросты аксонов должны быть флуоресцентными. Выровняйте каждый эмбрион так, чтобы ядро, выходящие аксоны и глаз образовали линию, и с помощью лезвия бритвы подстригите агарозу параллельно этой линии. Затем заполните вибратомную камеру ледяным буфером для срезов и приклейте первый эмбрион к стадии вибратома так, чтобы лезвие было параллельно глазодвигательному ядру и глазам.

Когда суперклей высохнет, погрузите вибратомную ступень так, чтобы эмбрион был ориентирован в сторону от лезвия, и используйте новое вибратоновое лезвие для получения срезов размером от 400 до 450 микрометров. Используйте стерильную трансферную пипетку, чтобы перенести каждый срез в буфер для холодной нарезки по мере его получения, и используйте флуоресцентный микроскоп, чтобы выбрать срез, содержащий глазодвигательные ядра и глаза.

С помощью стерильной трансферной пипетки перенесите срез на клеточную культуру, вставьте в 6-луночный планшет, содержащий 1,5 миллилитра питательной среды на лунку, и поместите планшет в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия. Удалите остаточную агарозу с нижней стадии и приклейте следующий эмбрион на стадию, продолжая собирать срезы до тех пор, пока все эмбрионы не будут разделены и покрыты, и визуализируйте срезы каждые 30 минут с помощью фазового контраста и флуоресцентной микроскопии в течение 72 часов.