Дифференцировка индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга

Начните с многолуночного планшета, содержащего индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки, или ИПСК в среде с ингибитором ро-киназы, который способствует выживанию клеток.

Замените среду незаменимой средой, содержащей питательные вещества и факторы роста.

Инкубируйте для обеспечения пролиферации и дифференцировки иПСК в клетки-предшественники.

Замените эту среду средой для дифференцировки с добавлением факторов роста фибробластов и ретиноевой кислоты, затем инкубируйте.

Факторы роста способствуют дифференцировке клеток-предшественников в микрососудистые эндотелиальные клетки, в то время как ретиноевая кислота способствует синтезу белков плотных соединений.

Промойте и обработайте клетки раствором фермента ЭДТА, чтобы отделить клетки, создав одноклеточную суспензию.

Центрифуга для сбора клеток и удаления надосадочной жидкости. Затем ресуспендируйте клетки в свежей среде для дифференцировки.

Поместите эту клеточную суспензию в многолуночную пластину, покрытую коллагеном и адгезионными белками.

Инкубируйте для обеспечения адгезии клеток, образуя плотные соединения между клетками, напоминающие микрососудистые эндотелиальные клетки мозга.

Чтобы индуцировать дифференцировку BMEC от человеческих ИПСК, промойте сливающуюся культуру ИПСК DPBS один раз перед инкубацией клеток с соответствующим объемом ферментативной ЭДТА в течение примерно пяти минут при 37 градусах Цельсия.

Когда получена суспензия одиночных клеток, соберите клетки центрифугированием и ресуспендируйте гранулу в соответствующем объеме среды стволовых клеток, дополненной 10 микромолярным ингибитором ROCK для подсчета.

Разбавьте клетки до концентрации 1,56 умножить на 10 до четвертой клетки на кубический сантиметр и засейте 2 миллилитра клеток в отдельные лунки с 6-луночным плоским дном. Через 24 часа в инкубаторе для клеточных культур замените надосадочную жидкость в каждой лунке на среду Е6 и верните планшет в инкубатор еще на четыре дня.

Чтобы очистить BMEC, полученные из iPSC, покройте субкультивирующие планшеты соответствующим объемом свежеприготовленного коллагена IV и раствора фибронектина на лунку и инкубируйте планшеты в течение как минимум двух часов при температуре 37 градусов Цельсия.

На 6-й день дифференцировки соберите клетки центрифугированием и ресуспендируйте гранулы в соответствующем объеме свежей среды без эндотелиальной сыворотки крови человека с добавлением B27, основного фактора роста фибробластов и ретиноевой кислоты. Поместите клетки в каждую лунку 24-луночной пластины с плоским дном, покрытой коллагеном и фибронектином.