Создание чипа гематоэнцефалического барьера с использованием клеток-предшественников, полученных из iPSC

Возьмем микрофлюидный чип с наложенными друг на друга каналами с матричным покрытием, разделенными пористой мембраной.

Засейте нейронные клетки-предшественники, полученные из iPSC, в верхнем канале. Инкубируйте для прилипания клеток, затем промойте, чтобы удалить неприкрепленные клетки.

Затем засейте микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга, полученные из иПСК, в нижний канал.

Переверните чип и инкубируйте его, чтобы прикрепить эндотелиальные клетки к мембранной стороне нижнего канала.

Затем переверните чип, чтобы прикрепить ячейки к нижней стороне канала, образуя однослойную трубчатую структуру. Промойте оба канала фильтрующим материалом для конкретных клеток.

Непрерывно протекает нейронная среда дифференцировки в верхнем канале и среда эндотелиальных клеток в нижнем канале.

Эндотелиальные клетки используют факторы роста от среды до зрелых и образуют плотные соединения, напоминающие кровеносный сосуд, формируя кровеносную сторону.

Нейротрофические факторы стимулируют дифференцировку нейронных клеток-предшественников в различные клетки мозга, формируя мозговую сторону. Эти клетки взаимодействуют с эндотелиальными клетками, создавая гематоэнцефалический барьер на чипе.

Для начала принесите блюдо с подготовленными чипсами в шкаф биобезопасности. С помощью пипетки P200 аккуратно промойте оба канала, добавив 200 микролитров среды нейронной дифференцировки во входное отверстие и вытянув жидкость из выпускного отверстия. Избегая контакта с портами, осторожно отсасывайте лишние капли среды с поверхности чипа.

Осторожно взбалтывайте клеточную суспензию, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию. Чтобы засеять нейронные клетки-предшественники, полученные из iPSC, в верхний канал для генерации мозговой стороны, добавьте наконечник P200, содержащий от 30 до 100 микролитров клеточной суспензии в концентрации 1 x 10⁶ клеток на миллилитр, во входное отверстие верхнего канала и осторожно освободите наконечник от пипетки.

Возьмите пустую пипетку P200, нажмите на поршень, вставьте ее в выходное отверстие верхнего канала и осторожно протяните одноклеточную суспензию через наконечник. Перенесите чип в микроскоп, чтобы проверить плотность затравки при равномерном распределении клеток в верхнем канале. После подтверждения плотности ячеек при 20% покрытии немедленно поместите чипы в инкубатор на два часа при температуре 37 градусов Цельсия.

После этого промойте клетки, которые не прикрепляются, добавив во входное отверстие свежую среду для нервной дифференцировки, и объедините жидкость пипеткой из выходного отверстия. Держите клетки в статических условиях при температуре 37 градусов Цельсия с ежедневной заменой среды нейронной дифференцировки. После прикрепления iNPC или на следующий день после посева принесите блюдо с приготовленными чипсами в шкаф для биобезопасности. Аккуратно промойте нижний канал 200 микролитрами среды эндотелиальных клеток.

Избегая контакта с портами, осторожно отсасывайте капли избыточной среды эндотелиальных клеток с поверхности чипа, следя за тем, чтобы среда оставалась в обоих каналах. Осторожно взбалтывайте клеточную суспензию, чтобы обеспечить однородную клеточную суспензию. С помощью пипетки P200 наберите от 30 до 100 микролитров суспензии микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга, полученной из iPSC, в концентрации от 14 до 20 x 10⁶ клеток на миллилитр и поместите наконечник во входное отверстие нижнего канала.

Наиболее важным этапом для достижения функциональных барьерных свойств является посев микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга. Крайне важно, чтобы затравить клетки с надлежащей плотностью, чтобы избежать образования пузырьков, чтобы убедиться в однородном распределении в оболочке органа.

Нажмите на поршень пипетки P200 с пустым наконечником, вставьте его в выходное отверстие нижнего канала и медленно отпустите поршень пипетки, чтобы осторожно протянуть одноэлементную суспензию через нижний канал. Отсасывайте лишнюю клеточную суспензию с поверхности чипа. Избегайте прямого контакта с входным и выпускным отверстиями, чтобы гарантировать, что суспензия элементов не будет высасываться из каналов. Перенесите чип в микроскоп, чтобы проверить плотность затравки.

Нижний канал заполнен ячейками без видимых промежутков между ними. После подтверждения правильной плотности клеток засейте клетки в оставшиеся чипы. Чтобы прикрепить клетки к пористой мембране, которая расположена в верхней части нижнего канала, переверните каждый чип и дайте им отдохнуть в колыбели для чипов. Поместите небольшой резервуар со стерильным DPBS внутрь 150-миллиметровой чашки, чтобы обеспечить влажность в клетках.

Инкубируйте чипсы при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно трех часов или до тех пор, пока не прикрепятся клетки в нижнем канале. После того, как микрососудистые эндотелиальные клетки головного мозга, полученные из iPSC, прикрепятся, переверните чипы обратно в вертикальное положение, чтобы обеспечить прикрепление клеток к нижней части нижнего канала. Через 48 часов после посева микрососудистых эндотелиальных клеток головного мозга, полученных из iPSC, уравновесьте температуру среды эндотелиальных клеток путем нагревания на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа.

Затем дегазируйте среду путем инкубации в вакуумной системе фильтрации в течение 15 минут. Затем продезинфицируйте внешнюю поверхность упаковки портативного модуля и лотков с 70% этанолом, протрите и перенесите их в шкаф для биобезопасности. Откройте упаковку и поместите модули в лоток. Расположите их вместе с резервуарами к задней части лотка. Пипеткой подайте 3 миллилитра предварительно уравновешенной теплой среды в каждый входной резервуар. Добавьте среду для культивирования эндотелиальных клеток во входной резервуар нижнего канала, а среду для нейронной дифференцировки — во входной резервуар верхнего канала верхнего канала.

Затем пипетируйте 300 микролитров предварительно уравновешенной теплой среды в каждый выходной резервуар непосредственно над каждым выходным отверстием. Разместите до 6 портативных модулей на каждом лотке. Поднесите лотки к инкубатору и полностью вставьте их в модуль для культивирования так, чтобы ручка лотка была обращена наружу. Выберите и запустите основной цикл в модуле культуры. Закройте дверцу инкубатора и дайте модулю культуры подготовить портативные модули в течение примерно одной минуты.

Цикл грунтовки завершается, когда в строке состояния отображается сообщение «Готово». Снимите лоток с модуля культивирования и поднесите его в шкаф биобезопасности. Осмотрите нижнюю часть каждого портативного модуля в шкафу биобезопасности, чтобы убедиться, что портативные модули были успешно заправлены. Ищите наличие мелких капель на всех четырех портах. Если какой-либо портативный модуль не показывает капли, повторите цикл prime на этих модулях. Если на лоток капнул носитель, что чаще всего происходит через выпускные отверстия, очистите лоток 70% этанолом.

Затем аккуратно промойте оба канала каждого чипа теплой сбалансированной питательной средой, специфичной для клеток, чтобы удалить любые возможные пузырьки в канале, и поместите небольшие капли среды в верхнюю часть каждого входного и выходного отверстий. Вставьте чипы с держателями в портативные модули, и поместите до шести на каждый лоток. Вставьте лотки в модуль культуры. Запрограммируйте соответствующие условия культивирования чипа органа, такие как скорость потока и растяжение на модуле культивирования. Как только цикл Регулирования завершен, который занимает около двух часов, запускаются запрограммированные условия. После этого культуральный модуль начинает протекать в заданных условиях культивирования органа-чипа.