$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмите эмбрион мыши в буфер и отделите череп, чтобы изолировать мозг.
Удалите мозговые оболочки, пленчатый слой, покрывающий мозг.
Рассеките мозг, чтобы разделить полушария.
Изолируйте дорсолатеральные головные мозги от полушарий и перенесите их в трубку.
Дорсолатеральные мозговые мозги богаты нейронами и нервными клетками-предшественниками.
Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость.
Добавьте раствор фермента. Ферменты разрушают тканевый матрикс, разрыхляя клетки.
Введите пролиферативную среду, содержащую сыворотку. Сывороточные белки подавляют активность ферментов.
С помощью пипетки можно механически диссоциировать ткань, образуя клеточную суспензию.
Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость, содержащую инактивированные ферменты и остатки тканей.
Ресуспендируйте клетки в пролиферирующей среде.
Перенесите клетки на микропланшет, покрытый субстратом для клеточной культуры.
Инкубируйте клетки, чтобы они прилипли к субстрату. Среда способствует пролиферации клеток-предшественников.
Начните с удаления мозга от 5 до 10 эмбрионов Е14 в чашке Петри с холодной средой для вскрытия. С помощью щипцов осторожно вытяните кожу и череп, а также изолируйте мозг. Во время работы под стереомикроскопом используйте щипцы для удаления мозговых оболочек. Затем разделите конечный мозг посередине, чтобы разделить полушария.
Для выделения дорсолатерального конечного мозга разрезают по дорсомедиальной кривой и паллиально-субпаллиальной границе. Перенесите дорсолатеральный конечный мозг в 2-миллилитровую трубку с рассекающей средой на льду до тех пор, пока не будут рассечены все мозги. После микродиссекции дорсолатерального конечного мозга поместите ткань в 15-миллилитровую коническую трубку.
Затем центрифугируйте пробирку, содержащую собранную ткань и среду для холодной диссекции, в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия и 340 раз g для осаждения ткани. После отжима удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки, и добавьте 1 миллилитр 37 градусов Цельсия 0,05% трипсина-ЭДТА для химического разложения. Выдерживать в течение 15 минут при температуре 37 градусов Цельсия.
После инкубации добавьте 2 миллилитра пролиферативной среды, чтобы подавить активность трипсина. Далее отполируйте кончик стеклянной пастеровской пипетки над газовой горелкой или горелкой Бунзена в течение нескольких секунд, чтобы немного сузить отверстие. Аспирируйте FCS, чтобы покрыть кончик пипетки. Затем механически диссоциируйте клетки с помощью отполированной огнем пипетки Пастера с покрытием FCS, проводя пипетирование вверх и вниз, стараясь при этом не образовывать пузырьки.
Центрифугируйте диссоциированные клетки в течение 5 минут при температуре 4 градуса Цельсия и 340 раз g. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки. Затем добавьте 1 миллилитр пролиферативной среды и ресуспендируйте клетки с помощью пипетки. Удалите PBS с предварительно обработанной пластины поли-D-лизином. Затем нарисуйте знак в нижней части таблички, который можно использовать в качестве ориентира для определения нулевой точки.
После повторного суспендирования клеток в пролиферирующей среде готовят разведение клеточной суспензии в соотношении 1:1 с использованием 0,4% раствора трипанового синего. Загрузите в предметные стекла счетной камеры и подсчитайте количество неокрашенных жизнеспособных клеток. Нежизнеспособные клетки будут синего цвета. Разведите клетки в пролиферирующей среде до получения10-6 клеток на миллилитр. Добавьте 500 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночного планшета для культивирования тканей и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.