Инфицирование первичных нейронов среднего мозга мышей сконструированными аденоассоциированными вирусами

Начните с эмбриональной культуры клеток среднего мозга мыши на покровном листе.

Лечение с помощью сконструированных аденоассоциированных вирусов, кодирующих флуоресцентный комплекс кальциевых индикаторов под нейрон-специфичным промотором.

Инкубация для прикрепления вируса и интернализации.

Удалите среду, чтобы удалить несвязанные вирусы, затем добавьте питательную среду и инкубируйте.

Интернализованные вирусы высвобождают свой геном в ядре, где нейрон-специфический промотор стимулирует выработку кальциевых индикаторных комплексов исключительно в первичных нейронах.

Эти комплексы включают флуоресцентный белок, меченный кальций-связывающим белком, и пептид M13.

Перенесите покровную крышку в чашку с записывающим буфером, богатым ионами кальция, затем поместите ее в записывающую камеру для конфокальной визуализации в реальном времени.

Введите глутаматный записывающий буфер, в результате чего глутамат связывается с ионными каналами, что приводит к поступлению ионов кальция.

Эти ионы связываются с комплексом, вызывая конформационное изменение и флуоресцентное излучение.

При визуализации в реальном времени яркие нейроны указывают на вирусную инфекцию.

Начните с приготовления 1 миллилитра