Приготовление срезов коры рида и гиппокампа из мозга щенка крысы

Возьмите только что собранный мозг крысиного щенка тыльной стороной вверх в культуральной тарелке с охлажденным буфером.

Откройте полушария мозга и удалите ткани, покрывающие гиппокамп.

Надрежьте полушария так, чтобы в них находились гиппокамп и ринальная кора.

Положите оба полушария гиппокампом вверх и параллельно на фильтровальную бумагу.

Перенесите этот узел на измельчитель тканей лезвием перпендикулярно полусферам.

Нарежьте полусферы до необходимой толщины для получения срезов и переложите их в культуральную тарелку с охлажденным буфером.

Аккуратно отделите срезы и рассеките их, чтобы включить в них структурно неповрежденные области коры гиппокампа и ринального налета.

Переложите срезы в мембранные вставки в многолуночную пластину, содержащую среду.

Удалите излишки буфера из срезов и инкубируйте их для восстановления тканей.

Обновите носители. Срезы могут быть использованы для дальнейшего анализа.

Перенесите мозг тыльной стороной вверх в 60-миллиметровую пластину, содержащую 5 миллилитров холодного ГБСС. Введите в мозжечок тонкие щипцы, а шпатель введите по средней линии, чтобы осторожно открыть полусферу. С помощью коротких изогнутых щипцов аккуратно удалите лишнюю ткань, покрывающую гиппокамп, не касаясь структуры гиппокампа. Затем разрежьте ниже каждого гиппокампа.

Перенесите по одному полушарию за раз, гиппокампом вверх и параллельно друг другу, на лист фильтровальной бумаги. Поместите фильтровальную бумагу на измельчитель тканей полусферами перпендикулярно лезвию и разрежьте полусферы на ломтики по 350 микрон. Переложите нарезанную ткань в новую чашку Петри, содержащую 5 миллилитров холодного GBSS, и с помощью электродов с круглым наконечником аккуратно отделите ломтики.

Сохраняя только образцы со структурно неповрежденной корой ринального головного мозга и гиппокампом, с помощью шпателя и электрода с круглым наконечником можно разместить до четырех неповрежденных срезов на отдельные вставки в соответствующее количество лунок шестилуночного планшета, содержащего 1,1 миллилитров питательной среды на лунку.

С помощью пипетки P20 удалите излишки диссекционной среды вокруг каждого среза. Поместите планшет в инкубатор для клеточных культур. Меняйте среду каждые два-три дня. С помощью щипцов приподнимайте вкладыш. Отсадите среду из соответствующей лунки и установите вставку на место. С помощью пипетки P1000 добавьте 1 миллилитр свежей среды температурой 37 градусов Цельсия в каждую лунку.