Разработка и поддержание бессывороточных эмбриоидных тел

Начните с лунки, содержащей нейронные клетки-предшественники или агрегаты NPC в дифференцирующих средах-1 или DM-1.

Эти NPC являются предшественниками нейронной линии, полученной из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека или ИПСК с использованием DM-1 в контролируемых условиях.

Перенесите агрегаты NPC на мембранную вставку, помещенную в лунку, содержащую DM-1, и удалите излишки среды.

Смените среду на ДМ-2 и инкубируйте.

DM-2 содержит питательные вещества и факторы дифференцировки, которые способствуют созреванию NPC в различные типы нервных клеток.

Недифференцированные NPC превращаются в эмбриоидные тела, известные как эмбриоидные тела без сыворотки или SFEBs, поскольку в среде отсутствует сыворотка. Эти БЭ напоминают морфологию развивающегося мозга.

Переложите вкладыш в лунку, содержащую ДМ-3.

DM-3 содержит факторы роста, необходимые для поддержания и роста SFEB.

Инкубируйте до тех пор, пока SFEB не достигнут желаемого размера.

После двух недель культивирования клеток приготовьте шестилуночные планшеты с 40-микронными вставками для клеточных культур и 1 миллилитром среды DM1. Инкубируйте эти планшеты не менее четырех часов перед добавлением культивируемых клеток.

Затем с помощью 200-микролитрового наконечника для пипетки с широким горлышком соберите двухнедельные клеточные агрегаты с примерно 20 микролитрами среды. Перенесите от четырех до шести агрегатов на каждую пластину с минимальным раствором. Удалите все излишки.

На этом этапе важно работать быстро и твердой рукой. При удалении среды вокруг SFEB вы можете увидеть, как SFEB перемещаются по раствору из-за поверхностного натяжения. После удаления носителя их можно переместить.

После того, как все агрегаты загружены на вкладыши, смените среду на 1 миллилитр DM2 и продолжайте культивирование клеток. Через день заменяйте 3/4 среды свежей средой. После 14 дней культивирования начните добавлять среду DM3 в культуры. Продолжайте культивацию еще 16 дней, чтобы вырастить SFEBs.