Создание 3D-модели совместного культивирования фибробластов и нейронов роговицы человека

Возьмем, к примеру, фибробласты роговицы человека.

Переложите их на мембранную вставку в многолуночную пластину, содержащую среду.

Добавьте носитель в мембранную вставку. Инкубируйте для прилегания фибробластов к вкладышу.

Далее замените среду на среду, содержащую витамин С в мембранной вставке и резервуаре.

инкубировать. Витамин С стимулирует фибробласты к секреции и сборке трехмерного внеклеточного матрикса.

Добавьте суспензию клеток нейробластомы человека поверх фибробластов.

Инкубировать, обеспечивая адгезию клеток нейробластомы.

Теперь добавьте на клетки среду, содержащую ретиноевую кислоту, и дополните резервуар свежей средой.

инкубировать. Ретиноевая кислота запускает дифференцировку клеток нейробластомы в нейральные клетки-предшественники.

Далее извлеките носитель. Внесите в водоем свежие среды. Добавьте в мембранный вкладыш среду, содержащую нейротрофический фактор, и инкубируйте.

Нейротрофические факторы запускают дифференцировку клеток-предшественников в нейроны, создавая 3D-модель совместной культуры фибробластов и нейронов роговицы человека.

Чтобы собрать 3D-конструкции, сначала пройдите и подсчитайте фибробласты роговицы человека. Затем высадите примерно 1 ум на 10-6 HCF на мембранную вставку из поликарбоната с порами 0,4 микрона. Добавьте к верху конструкции 1,5 миллилитра свежей среды. Затем пипеткой нанесите еще 1,5 миллилитра той же среды на дно каждой конструкции.

Через 24 часа добавьте по 1,5 миллилитров среды, дополненной 0,5 миллимоляром витамина С, в верхнюю и нижнюю части каждого конструкта. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе в течение трех недель, добавляя свежую среду, содержащую витамин С, через день. Это будет стимулировать клетки к секреции и сборке собственного внеклеточного матрикса. Через три недели добавьте 8 раз по 10 к 3 клеткам нейробластомы человека SH-SY5Y поверх ранее собранных 3D-конструкций.

На этом этапе очень важно рассчитать точное количество клеток и дать 24 часа до начала дифференцировки клеток.

После 24 часов инкубации инициируйте дифференцировку клеток SH-SY5Y, стимулируя клетки 1,5 миллилитрами EMEM с 10% FBS и 10 микромолярной ретиноевой кислотой. Затем добавьте на дно конструкции 1,5 миллилитра среды, содержащей витамин С. Ретиноевая кислота светочувствительна, поэтому этот этап следует выполнять в темное время суток.

Через пять дней, когда клетки достигли фазы дифференцировки, добавьте в верхнюю часть конструкции 1,5 мл бессывороточной среды, содержащей 2 наномоляра BDNF и 1% антибиотика-антимикотика. Добавьте свежую среду с добавлением витамина С на дно конструкции. Культивируйте клетки в течение двух дополнительных дней перед обработкой для дальнейшего анализа.