$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Начните с иммобилизованного среза мозга мыши, помещенного в регистрирующую камеру электрофизиологической установки, заполненную искусственной спинномозговой жидкостью для поддержания жизнеспособности нейронов.
Установка содержит предварительно собранную записывающую микропипетку, наполненную катионным раствором, подключенную к усилителю и блоку контроля давления.
Под микроскопом найдите нейрон и расположите микропипетку рядом с ним.
Приложите положительное давление воздуха, чтобы очистить от мусора.
Перемещайте микропипетку по направлению к нейрону до тех пор, пока на мембране не образуется ямочка, указывающая на близость нейронов.
Примените слабое всасывание, чтобы втянуть небольшой мембранный пластырь внутрь микропипетки.
Это создает плотное уплотнение, которое увеличивает сопротивление микропипетки, подтверждая стабильное уплотнение.
Поддерживайте потенциал клетки на физиологическом уровне покоя для стабильности клетки.
Затем примените кратковременное, сильное отсасывание, чтобы нарушить мембрану патча, установив прямую связь с внутренней частью клетки.
Эта конфигурация цельной клетки готова к регистрации электрической активности нейронов.
С помощью колеса точной фокусировки микроскопа начните фокусироваться вниз, постепенно опуская микропипетку. Всегда сначала фокусируйтесь вниз, а затем опускайте микропипетку в плоскость фокусировки, чтобы кончик микропипетки не проникал резко в срез. Когда микропипетка соприкоснется с поверхностью среза, замедлите скорость микроманипулятора до средне-низкого режима. Осторожно надавливайте легкими положительными нагрузками, чтобы убрать мусор на дорожке.
Затем подойдите к ячейке, чередуя ручки управления X, Y, Z или приближаясь по диагонали, где обе оси XZ изменяются при вращении ручки оси Z. Когда микропипетка находится достаточно близко к клетке, на поверхности клетки появляется ямочка.
Теперь примените слабое и кратковременное всасывание через трубку, которая соединена с всасывающей трубкой держателя пипетки, чтобы создать уплотнение. Во время формирования гигасил используйте управляемый компьютером усилитель, чтобы довести удерживающий потенциал клеток до физиологического потенциала покоя, чтобы предотвратить резкие изменения после разрыва мембраны. После того, как гигауплотнение сформируется, компенсируйте быструю или медленную емкость.
Здесь очень важно, чтобы применяемое отсасывание не было слишком сильным, в противном случае мембрана может разорваться до установления уплотнения.
Если уплотнение остается стабильным и выше 1 гигаом, примените кратковременное и сильное всасывание для разрыва плазматической мембраны.
Всасывание должно быть коротким и более сильным, чем давление, прилагаемое при установлении уплотнения, чтобы правильно разорвать мембрану и достичь стабильной конфигурации целых клеток.