Патч-Клэмпинг Записи из дендрита дофаминергического нейрона в срезе мозга

Начните с электрофизиологической установки с иммобилизованным срезом мозга, погруженным в искусственную спинномозговую жидкость или аКСФ, содержащую различные ионы.

Установка включает в себя патч-пипетку, наполненную богатым калием раствором, подключенную к записывающему электроду и усилителю.

Подавайте положительное давление воздуха на пипетку, чтобы предотвратить ее засорение. Затем расположите его рядом с дендритом, принимающим сигнал продолжением дофаминергического нейрона.

Полученное в результате углубление мембраны подтверждает близость к дендриту.

Ослабьте положительное давление, чтобы создать всасывание, образуя плотное уплотнение между пипеткой и дендритной мембраной.

Запишите начальное движение ионов в виде тока действия при базовом напряжении.

Втокаемый aCSF с блокаторами натриевых и кальциевых каналов для блокировки соответствующих каналов, предотвращая движение ионов через них.

Подайте отрицательное напряжение, чтобы открыть потенциал-зависимый катионный канал.

Этот канал позволяет ионам калия проникать в нейрон, увеличивая ток действия и предполагая стимуляцию дендрита в дофаминергическом нейроне.

При этой процедуре срез мозга переносится в записывающую камеру. Закрепите срез в нижней части записывающей камеры платиновым кольцом и убедитесь, что срез хорошего качества с гладкой ровной поверхностью. Затем выберите нейрон с дендритом, простирающимся на большое расстояние в той же плоскости, и убедитесь, что интересующий вас дендрит может быть прослежен до четко определенной сомы. Далее заполните патч-пипетку раствором электрода.

Чтобы залатать дендрит в режиме, прикрепленном к ячейке, определите часть дендрита и сфокусируйтесь на ней. Надавите на пипетку, и опустите ее с помощью микроманипулятора. Затем расположите пипетку близко к мембране и отрегулируйте давление, чтобы создать небольшую ямочку. Затем ослабьте давление на наконечник пипетки и заплатите дендрит, контролируя сопротивление пипетки. Постарайтесь получить сопротивление уплотнения больше 1 гигаОм, в лучшем случае от 3 до 10 гигаОм для записей, подключенных к сотовой сети.

После этого отведите пипетку от мембраны на пару микрометров, чтобы избежать деформации дендрита. Наблюдаемые здесь токи действия представляют собой потенциалы спонтанного действия нигральных нейронов. Для подавления токов действия применяют блокаторы кальциевых и натриевых каналов к ACSF. Затем примените шаг напряжения, равный отрицательным 90 мВ от удерживающего потенциала 0 мВ, чтобы вызвать ток катионов, активированный гиперполяризацией.