Подача шумовых токов на медиальные нейроны вестибулярного ядра с помощью метода Whole-Cell Patch-Clamp

Возьмите срез ствола мозга мыши, содержащий медиальное вестибулярное ядро, или MVN.

Закрепите срез в записывающей камере, заполненной искусственной спинномозговой жидкостью, чтобы сохранить жизнеспособность нейронов.

Визуализируйте срез под микроскопом, чтобы найти нейроны MVN.

Приложите положительное давление, чтобы микропипетка, наполненная раствором, имитирующим внутриклеточную среду, прошла через ткани.

Когда пипетка контактирует с нейроном, мембрана нейронов будет углубляться.

Приложите отрицательное давление, чтобы аспирировать небольшой участок мембраны, создавая плотное уплотнение.

Затем подайте импульсы отрицательного давления, чтобы разорвать мембрану, создав непрерывную связь между нейроном и пипеткой.

Примените случайные амплитуды шума к нейрону и определите подпороговую амплитуду, за пределами которой шум вызывает возбуждение нейронов.

Наконец, примените к нейрону ряд электрических стимулов в сочетании с подпороговой амплитудой случайного шума.

Измерьте усиление нейронов — способность нейрона модулировать свою реакцию возбуждения на стимулы в присутствии шума.

Для электрофизиологии цельноклеточного зажима сначала вытащите микропипетки с конечным сопротивлением, которое будет составлять от 3 до 5 мегаОм при заполнении внутренним раствором на основе калия, и поместите в ванну. Чтобы получить записи клеточного зажима от отдельных нейронов в MVN, перенесите один срез ткани из инкубационной камеры в записывающую камеру стандартной электрофизиологической установки и используйте нейлоновую нить на U-образном грузике для фиксации среза.

Непрерывно перфузируйте записывающую камеру карбогенированным aCSF при температуре 25 градусов Цельсия со скоростью потока три миллилитра в минуту и заполните микропипетку внутренним раствором. С помощью пипетки надавите на небольшое положительное давление, чтобы оттолкнуть мусор от наконечника пипетки. Используя цель с более низкой мощностью, найдите MVN, прежде чем переключаться на высокую мощность, чтобы найти отдельные нейроны в MVN.

Прежде чем проникнуть пипеткой в ткань, приложите небольшое положительное давление, чтобы оттолкнуть мусор от наконечника пипетки, и с помощью микроманипулятора переместите пипетку к выбранному нейрону. На мембране нейронов должна образоваться небольшая ямочка. Сбросьте положительное давление и приложите небольшое отрицательное давление.

После того, как будет достигнуто уплотнение в один гигаом, подайте мягкое, короткое и резкое отрицательное давление на держатель пипетки через всасывающее отверстие, чтобы разорвать мембрану и создать конфигурацию всей клетки. Затем получите записи токовых клещей всей ячейки в соответствии со стандартными протоколами.

Чтобы применить стохастический и синусоидальный шум к отдельным нейронам медиального вестибулярного ядра, установите диапазон амплитуд от 3 до 24 пикоампер для определения нейронального порога и скорости возбуждения, а также сгруппируйте нижнюю и высокую интенсивности стимула для определения сенсорного порога.

Затем рассчитайте среднюю скорость срабатывания за 10-секундный период, в течение которого будет вводиться шаг деполяризующего тока для каждого отдельного уровня тока. Используйте средние значения скорости стрельбы для создания коэффициента скорострельности по отношению к текущему графику. Затем выполните линейный регрессионный анализ, чтобы определить градиент линии наилучшего соответствия для определения прироста нейронов.