Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:57 мин. • July 8th, 2025
Возьмем ганглиозные клетки сетчатки данио-рерио, культивируемые на покрытых покровных стеклах.
Эти клетки экспрессируют генетически кодируемый биосенсор, который производит окислительно-восстановительный зеленый флуоресцентный белок roGFP2, слитый с чувствительным к перекиси водорода ферментом Orp1.
Перенесите покровное стекло с носителем в камеру для визуализации живых клеток и поместите камеру на инвертированный микроскоп.
Замените фильтрующий материал на фильтрующий материал, не содержащий сыворотки, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию.
Из-за низкого уровня перекиси водорода roGFP2 остается в своей восстановленной конформации.
Возбуждайте биосенсор последовательно на длинах волн 405 и 480 нм.
Восстановленный roGFP2 проявляет пик возбуждения при длине волны 480 нм.
Перейдите на среду, содержащую перекись водорода.
Перекись водорода попадает в клетки и вступает в реакцию с Orp1, окисляя roGFP2.
Снова возбуждайте биосенсор.
Окисленный roGFP2 демонстрирует увеличение флуоресценции при 405 нм и снижение при 480 нм.
Рассчитайте отношение интенсивности флуоресценции.
Увеличение соотношения свидетельствует о повышенном уровне перекиси водорода в клетках.
В день визуализации проверьте
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео