JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 2:57 мин • July 8th, 2025
Возьмем ганглиозные клетки сетчатки данио-рерио, культивируемые на покрытых покровных стеклах.
Эти клетки экспрессируют генетически кодируемый биосенсор, который производит окислительно-восстановительный зеленый флуоресцентный белок roGFP2, слитый с чувствительным к перекиси водорода ферментом Orp1.
Перенесите покровное стекло с носителем в камеру для визуализации живых клеток и поместите камеру на инвертированный микроскоп.
Замените фильтрующий материал на фильтрующий материал, не содержащий сыворотки, чтобы уменьшить фоновую флуоресценцию.
Из-за низкого уровня перекиси водорода roGFP2 остается в своей восстановленной конформации.
Возбуждайте биосенсор последовательно на длинах волн 405 и 480 нм.
Восстановленный roGFP2 проявляет пик возбуждения при длине волны 480 нм.
Перейдите на среду, содержащую перекись водорода.
Перекись водорода попадает в клетки и вступает в реакцию с Orp1, окисляя roGFP2.
Снова возбуждайте биосенсор.
Окисленный roGFP2 демонстрирует увеличение флуоресценции при 405 нм и снижение при 480 нм.
Рассчитайте отношение интенсивности флуоресценции.
Увеличение соотношения свидетельствует о повышенном уровне перекиси водорода в клетках.
В день визуализации проверьте клетки под микроскопом, чтобы подтвердить рост аксонов RGC. Для визуализации живых клеток перенесите покровные стекла из чашки для культивирования в камеру для визуализации живых клеток. Используйте инвертированный микроскоп с объективом DIC, длинночастотным красным фильтром OG590 и камерой EM-CCD.
Перед созданием образа замените носитель ZFCM+ на ZFCM-. После позиционирования ячеек с помощью 10-кратного объектива получите изображения с 60-кратным увеличением с помощью масляного иммерсионного объектива. Используйте дополнительное 1,5-кратное увеличение.
Сначала получите изображения DIC, затем изображение roGFP2-Orp1 с помощью соответствующего набора фильтров. После получения первого набора изображений замените носители на носители, содержащие различные лечебные растворы. Среду следует менять каждые 30 минут визуализации, чтобы избежать изменения pH и осмолярности.