Создание конфигурации цельной клетки для двухфотонной визуализации кальция в срезах мозга

Примите стимуляционную пипетку, содержащую нечувствительные к красному кальцию флуорофоры в искусственной спинномозговой жидкости (ACSF).

Расположите пипетку рядом с целевым нейроном в срезе гиппокампа.

Поместите рядом с мишенью патч-пипетку с записывающим электродом, пропитанным электролитом, содержащим красные нечувствительные к кальцию и зеленые индикаторные флуорофоры кальция.

Применяйте постоянное положительное давление, чтобы кратковременно нарушить поверхность тканей, указывая на близость к цели.

Когда ямочка образуется на мембране нейрона, ослабьте давление, чтобы сформировать уплотнение.

Приложите отрицательное давление, чтобы затянуть уплотнение.

Стабилизируют мембранный потенциал при постоянном отрицательном напряжении.

Продолжайте с отрицательным давлением, чтобы разорвать мембрану, позволяя флуорофорсодержащим электролитам распространяться внутри нейрона.

Визуализируйте красную флуоресценцию целевого дендритного шипика и выровняйте пипетку для стимуляции рядом с ним.

Применяйте электрические импульсы, чтобы открыть кальциевые каналы.

Используйте двухфотонную микроскопию для визуализации временных изменений уровня кальция, на которые указывает зеленая флуоресценция.

На этом этапе перенесите срез гиппокампа в ванну под объективом лазерного сканирующего двухфотонного микроскопа. Непрерывно перфузируйте ванну с кислородосодержащим ACSF в норме. Затем с помощью инфракрасной дифференциально-интерференционной контрастной микроскопии можно определить местоположение интересующей клетки по ее размеру, форме и положению.

После этого заполните стимулирующую пипетку нормальным раствором ACSF, содержащим красный флуорофор. Опустите его сверху на срез так, чтобы кончик оказался в той же области, что и интересующая ячейка. После этого наполните пипетку для пластыря раствором и прикрепите ее к головному столику. Установите его над срезом так, чтобы его кончик находился прямо над интересующей клеткой.

Впоследствии вставьте шприц в трехходовой запорный кран и подключите его к патч-пипетке через пластиковую трубку. Введите постоянное положительное давление в патч-пипетку и удерживайте запорный кран в закрытом положении. Опустите дозатор пластыря так, чтобы он оказался прямо над целевой клеткой. При контакте с клеточной мембраной снимите давление, повернув запорный кран в открытое положение.

Затем с помощью пустого шприца, вставленного в запорный кран, слегка надавите на пипетку-патч, пока сопротивление пипетки не достигнет 1 гигаом. В окне тестирования мембраны программного обеспечения для сбора данных зажмите ячейку при отрицательном напряжении 60 милливольт. Продолжайте оказывать отрицательное давление до тех пор, пока сопротивление пипетки не упадет и не будет достигнута вся конфигурация ячейки.

Чтобы зарегистрировать дендритные кальциевые переходные процессы, индуцированные электрической стимуляцией, найдите интересующий дендрит с помощью красного флуоресцентного сигнала. Установите стимулирующую пипетку на поверхность среза над интересующим дендритом. Медленно опускайте дозатор стимуляции на 10–15 микрометров от дендрита, сводя к минимуму движение, чтобы не нарушить конфигурацию всей клетки.