Запись токов в целых клетках с помощью ГАМК-пыхтения в срезе мозга мыши

Начните с безопасного префронтального коркового среза мозга в искусственной спинномозговой жидкости, или КСФ, в записывающей камере электрофизиологической установки.

Этот aCSF содержит блокатор ионных каналов натрия, который ингибирует натриевые каналы в нейронах.

Поместите слойную микропипетку, наполненную гамма-аминомасляной кислотой, или ГАМК, над постсинаптическим нейроном.

Поместите заполненную ионным раствором записывающую микропипетку с электродом рядом с тем же нейроном.

Применяйте слабое отсасывание для создания плотного уплотнения с помощью небольшого участка нейронной мембраны.

Затем примените сильное всасывание, чтобы разрушить заплатанную мембрану, обеспечивая доступ к внутренней части нейрона.

Доставляйте ГАМК, тормозной нейромедиатор, который связывается с лиганд-зависимым хлоридным каналом на постсинаптических нейронах.

Это открывает канал и позволяет ионам хлора проникать в нейроны, генерируя тормозящий постсинаптический ток.

При постоянном напряжении запишите постсинаптический ток. Увеличение тормозящего постсинаптического тока отражает роль ГАМК в ингибировании нейронной активности.

Перенесите срез мозга в записывающую камеру с помощью пастеровской пипетки с тонким концом, срезанным по размеру среза. Затем поместите якорь из платинового среза над срезом, чтобы удерживать его на платформе. После этого заполните записывающие микропипетки внутренним раствором, а надувные микропипетки заполните ГАМК на 10 микромолярах, 50 микромолярах и 100 микромолярах или аКСФ в качестве транспортного контроля.

Чтобы предотвратить закупорку мусором, приложите небольшое положительное давление с помощью одномиллилитрового шприца перед погружением записывающего электрода в ФКСФ. Расположите записывающий электрод под микроскопом и затяните микропипеткой так, чтобы кончики оказались в центре монитора. Затем определите целевой нейрон. Отрегулируйте фокус микроскопа, постепенно опуская пуховую микропипетку, и расположите ее над регистрирующим нейроном под углом 45 градусов.

Соблюдайте расстояние между кончиком пуховой микропипетки и целевым нейроном в пределах от 20 до 40 микрометров. Медленно и осторожно подойдите к нейрону с помощью записывающего электрода, а затем ослабьте положительное давление. Примените слабое и кратковременное всасывание через трубку, соединенную с держателем электрода, чтобы создать гигаомное уплотнение. Поддерживайте напряжение на уровне нуля милливольт.

После образования гигаомного уплотнения компенсируйте быструю и медленную емкость вручную или автоматически. Затем примените кратковременное и сильное всасывание через трубку, чтобы перейти в режим цельных ячеек. Впоследствии запись вызванных IPSC токов в режиме напряжения-зажима.

Подавайте одиночные или спаренные слойки GABA через слойную микропипетку, управляемую ведущим восьмивольтным шаговым генератором. Изменяйте продолжительность затяжки, чтобы получить наилучшие результаты вызванных токов IPSC и измерять вызванные токи IPSC.