Электрофизиологические записи для оценки регенерации нейронов в сокультурных срезах спинного мозга

Возьмем, к примеру, многоэлектродную матрицу с полимерным покрытием или MEA, в которой совместно культивируемые эмбриональные срезы спинного мозга расположены в двух отдельных зонах, что позволяет одновременно записывать данные с обоих срезов.

На срезе видны регенерированные нейронные связи в ранее пораженной области.

Поместите MEA в записывающую камеру, содержащую внеклеточный раствор, богатый ионами и питательными веществами для поддержания выживания нейронов.

Позволяют системе стабилизироваться, облегчая адаптацию нейронов и коммуникацию.

Нейроны общаются с помощью электрических сигналов, называемых потенциалами действия, которые регистрируются ближайшими электродами в MEA.

Отдельные сигналы от каждого электрода объединяются, производя электрический сигнал от каждого среза.

Регулярно заменяйте внеклеточный раствор для поддержания стабильности нейронов.

Добавьте внеклеточный раствор с ингибиторами, которые блокируют тормозные нейротрансмиттеры рецепторов на мембранах нейронов, поддерживая активность нейронов в течение более длительного времени.

Сравните электрическую активность обоих срезов. Синхронизированный электрический сигнал между двумя срезами подтверждает наличие синаптических связей и успешную регенерацию нейронов.

Поместите внутрь под стереомикроскоп чашку Петри с покрытой микроэлектродной матрицей. Сфокусируйте решетку и центрируйте каплю куриной плазмы объемом шесть микролитров на электродной решетке. С помощью небольшого шпателя осторожно проведите два участка спинного мозга вентральными сторонами друг к другу в каплю плазмы.

Далее добавьте восемь микролитров тромбина вокруг куриной плазменной капли. Затем с помощью наконечника пипетки тщательно перемешайте и распределите куриную смесь плазмы и тромбина. Непосредственно перед тем, как куриная плазма и тромбиновая смесь станет слишком тягучей и начнет свертываться, отасуньте лишнюю жидкость. Затем закройте чашку Петри крышкой и поместите ее во увлажненную камеру.

Поместите камеру внутрь инкубатора при температуре 37 градусов Цельсия примерно на час. После инкубации осторожно добавьте в пробу 10 микролитров питательной среды. Закройте чашку Петри крышкой и поместите ее обратно в инкубатор еще на 45 минут. Затем поместите каждую из культур с многоэлектродной матрицей в роликовую трубку и добавьте три миллилитра питательной среды. Плотно закройте крышку и поместите роликовую трубку в роликовый барабан. Вращайте барабан со скоростью от 1 до 2 об/мин в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия.

С помощью стерильных щипцов с резиновыми наконечниками извлеките сборки культур с многоэлектродной матрицей из роликовой трубки и поместите их в чашку Петри под стереомикроскопом. Сфокусируйте ткань и убедитесь, что два среза срослись. Затем удерживайте сборку неподвижно и поместите лезвие скальпеля в паз многоэлектродной решетки рядом с срезами ткани. Держите скальпель довольно горизонтально, а затем поднимите рукоятку скальпеля вверх, но пусть лезвие скальпеля остается в пазу массива таким образом, чтобы лезвие катилось от основания к кончику, разрезая ткань, закрывая бороздку.

При необходимости разорвите все остаточные тканевые соединения кончиком иглы 25-го калибра. Работайте только в области внутри канавки, и не трогайте нежные края. Поместите сборки культур с многоэлектродной матрицей обратно в роликовую трубку и добавьте к культурам три миллилитра свежей питательной среды. Затем поместите роликовую трубку обратно на роликовый барабан в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия.

Установите узел культуры с многоэлектродной матрицей в записывающую камеру и нанесите на матрицу около 500 микролитров внеклеточного раствора. Затем установите сборку на микроскоп. Подождите 10 минут, пока система стабилизируется, а затем в течение 10 минут записывайте основную спонтанную активность каждого из электродов, обнаруживающих активность. Повторите записи в общей сложности два раза.

Чтобы обеспечить стабильные внеклеточные условия, заменяйте внеклеточный раствор после каждого сеанса записи. При желании растормаживайте сетку путем применения внеклеточного раствора, содержащего один микромоль стрихнина и 10 микромоляров габазина, и подождите не менее двух минут, прежде чем регистрировать электрическую активность.