Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:10 мин. • July 8th, 2025
Начните с камеры регистрации поведения, содержащей обезболенную трансгенную личинку данио-рерио, обездвиженную в легкоплавкую агарозу.
Область претектума среднего мозга личинки и нижняя доля гипоталамуса содержат модифицированные нейроны, экспрессирующие флуоресцентные показатели кальция.
Удалите агарозу вокруг головы личинки и промойте водой, чтобы удалить остатки агарозы.
Поместите парамеций в качестве добычи рядом с личинкой.
Перенесите записывающую камеру под флуоресцентный микроскоп.
Когда добыча плавает, глаз личинки обнаруживает ее и посылает сигнал в области претектума и гипоталамуса, участвующие в обнаружении добычи.
Это открывает кальциевые каналы в этих нейронах, позволяя ионам кальция проникать и связываться с показателями кальция, что приводит к излучению флуоресценции.
Запишите покадровую съемку, чтобы определить интенсивность флуоресценции нейронов вдоль траектории плавания добычи и создать цветовую карту.
На этой карте наконечники стрелок представляют траектории добычи: черные стрелки не показывают возбуждения нейронов, в то время как цветные стрелки указывают на повышенное возбуждение нейронов, вызванное движением добычи.
После культивирования парамеции и обезболивания личинки данио-рерио в соответствии с текстовым протоколом поместите личинку в агарозу с низкой температурой плавления 2% и немедленно удалите излишки агарозы так, чтобы поверхность агарозы выглядела слегка выпуклой. С помощью рассекающей иглы быстро сориентируйте личинку в вертикальном положении.
Затем с помощью хирургического ножа сделайте несколько небольших надрезов в агарозе, чтобы удалить агарозу вокруг головы данио-рерио, что освобождает место для плавания парамеция. Аккуратно удалите остатки агарозы, аккуратно вылив воду системы на камеру. Затем поместите один парамеций в записывающую камеру, чтобы он служил визуальным стимулом.
Затем поместите записывающую камеру под эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный научной CMOS-камерой, и выберите объектив с 2,5-кратным увеличением. Запустите приложение для получения изображений для установленной камеры. Нажмите кнопку Sequence Pane и выберите Hard Disk Record (Запись на жестком диске) на панели. В разделе «Настройки сканирования» установите количество кадров на 900 или любое другое общее количество кадров.
На панели «Захват» установите для параметра «Время экспозиции» значение 30 миллисекунд, а для параметра «Группирование» — значение 2 на 2. Нажмите «В реальном времени» на панели захвата, чтобы найти личинку в поле зрения камеры и сфокусироваться, а затем нажмите «Остановить прямой эфир» и нажмите кнопку «Запустить». Сохраните фильм в формате .cxd и проанализируйте данные в соответствии с текстовым протоколом.