Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:01 мин. • July 8th, 2025
Возьмем трансгенные черви Caenorhabditis elegans, растущие на агаровом блоке.
Эти черви экспрессируют индикатор кальция, GCaMP5, и нечувствительный к кальцию флуоресцентный белок mCherry, в нейронах, которые регулируют поведение при откладывании яиц.
Установите червей на инвертированный предметный столик микроскопа.
Визуализируйте GCaMP5 и флуоресценцию mCherry.
Перед высвобождением яйцеклеток нейроны активируются, открывая потенциал-зависимые кальциевые каналы, которые обеспечивают приток кальция.
Внутриклеточный кальций связывается с GCaMP5, изменяя его конформацию и увеличивая флуоресценцию.
Между тем, флуоресценция mCherry остается неизменной, что позволяет отслеживать нейрон.
Активированные нейроны высвобождают нейротрансмиттеры, которые связываются с определенными мышечными рецепторами, вызывая высвобождение яйцеклеток.
После высвобождения кальциевые каналы закрываются, уменьшая приток кальция и флуоресценцию GCaMP5.
Затем сделайте снимки светлого поля, чтобы наблюдать за движением червя.
Снижение подвижности происходит из-за сокращений мышц до выхода яйцеклетки.
После выпуска яйцеклеток мышцы расслабляются, восстанавливая нормальную подвижность.
Измерьте коэффициент флуоресценции GCaMP5-mCherry и скорость червя, чтобы обнаружить события выхода яиц.
Для ратиометрической визуализации кальция на вкладке «Последовательность» нажмите «Старт», чтобы начать запись, и отслеживайте червя с помощью джойстика, удерживая интересующие клетки и синапсы в фокусе в центре поля зрения. В момент начала флуоресцентной записи триггеры отправляются на ожидающую светлопольную камеру и контроллер сцены, которые начинают собирать синхронизированные изображения и положение сцены.
Нажмите кнопку «Статистика» в окне гистограммы, чтобы отобразить статистику по пикселям для каждого канала. Отрегулируйте мощность светодиода, чтобы обеспечить максимальную однопиксельную флуоресценцию mCherry на пресинаптическом конце более или равную 8 000 отсчетов в красном канале, что дает примерно 12-битный динамический диапазон над фоном. Кальциевые репортерные сигналы на пресинаптическом конце во время покоя, или при низком уровне кальция, должны составлять около 2500 отсчетов в зеленом канале.
Записывайте поведение до тех пор, пока не будет достигнуто одно активное состояние яйцекладки. Затем сохраните 10-минутное подмножество, содержащее 6 000 кадров до и 6 001 кадр после первого события откладывания яиц. Позаботьтесь о том, чтобы сохранить одно и то же подмножество яркопольных изображений поведения червя и временных точек положения x,y ступени, иначе точная синхронизация потоков данных будет потеряна.