Изучение возбудимости флуоресцентных нейронов с помощью зажима для целых клеток

Возьмите иммобилизованный трансфицированный корональный срез мыши в записывающей камере, перфузированной ХКБ.

Срез содержит разреженную популяцию пирамидальных нейронов, экспрессирующих фермент-мишень и флуоресцентный белок.

Соберите записывающую пипетку, состоящую из внутриклеточного раствора и электрода, подключенного к усилителю для измерения нейронных сигналов.

Микроскопически идентифицируют целевой участок ткани и локализуют флуоресцентный нейрон.

Надавите на пипетку, чтобы предотвратить засорение и продвинуть ее к целевому нейрону.

Положительное давление вызывает небольшое углубление на мембране нейронов при контакте.

Ослабьте давление, образуя плотное уплотнение между мембраной и наконечником.

Установите удерживающий потенциал на постоянное отрицательное значение, чтобы стабилизировать нейрон.

Приложите кратковременное отрицательное давление, чтобы разорвать мембрану, соединив цитоплазму с внутренней частью пипетки и создав конфигурацию всей клетки.

Переключитесь в режим токоизмерительных клещей и подайте импульсы положительного тока, генерируя потенциалы действия, свидетельствующие о возбудимости нейронов.

Перенесите срез в записывающую камеру с помощью пастеровской пипетки или небольшой кисточки. Зажмите ломтик арфой, и перфузируйте его с помощью ACSF со скоростью 2 миллилитра в минуту. Чтобы запатчить GFP-положительный нейрон, определите местоположение интересующей области через микроскоп с кратностью 10x. Затем найдите GFP-положительную клетку с помощью цели 60x.

Далее заполните записывающий электрод внутриклеточным раствором. Затем поместите стеклянную пипетку в держатель пипетки. После этого поместите наконечник пипетки в ванну и сосредоточьтесь на наконечнике. Как только пипетка окажется в ванне, подайте положительное давление через систему контроля обратного давления.

Подойдите к интересующей точке под визуальным контролем, сохраняя при этом противодавление в пипетке. При появлении небольшой ямочки на поверхности клетки сбросьте давление. На этом этапе может образоваться герметичное уплотнение с сопротивлением более 1 гигаом. В противном случае приложите легкое отрицательное давление, чтобы облегчить это.

Пока уплотнение формируется, доведите удерживающее напряжение-зажим до минус 60 милливольт. Как только гигаомное уплотнение будет сформировано, примените импульс всасывания, чтобы разорвать клеточную мембрану и перейти в режим полноклеточного уплотнения. Как только он перейдет в режим работы со всей ячейкой, переключитесь с напряжения на режим токового клеща и начните запись.