$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Возьмите иммобилизованный трансфицированный корональный срез мыши в записывающей камере, перфузированной ХКБ.
Срез содержит разреженную популяцию пирамидальных нейронов, экспрессирующих фермент-мишень и флуоресцентный белок.
Соберите записывающую пипетку, состоящую из внутриклеточного раствора и электрода, подключенного к усилителю для измерения нейронных сигналов.
Микроскопически идентифицируют целевой участок ткани и локализуют флуоресцентный нейрон.
Надавите на пипетку, чтобы предотвратить засорение и продвинуть ее к целевому нейрону.
Положительное давление вызывает небольшое углубление на мембране нейронов при контакте.
Ослабьте давление, образуя плотное уплотнение между мембраной и наконечником.
Установите удерживающий потенциал на постоянное отрицательное значение, чтобы стабилизировать нейрон.
Приложите кратковременное отрицательное давление, чтобы разорвать мембрану, соединив цитоплазму с внутренней частью пипетки и создав конфигурацию всей клетки.
Переключитесь в режим токоизмерительных клещей и подайте импульсы положительного тока, генерируя потенциалы действия, свидетельствующие о возбудимости нейронов.
Перенесите срез в записывающую камеру с помощью пастеровской пипетки или небольшой кисточки. Зажмите ломтик арфой, и перфузируйте его с помощью ACSF со скоростью 2 миллилитра в минуту. Чтобы запатчить GFP-положительный нейрон, определите местоположение интересующей области через микроскоп с кратностью 10x. Затем найдите GFP-положительную клетку с помощью цели 60x.
Далее заполните записывающий электрод внутриклеточным раствором. Затем поместите стеклянную пипетку в держатель пипетки. После этого поместите наконечник пипетки в ванну и сосредоточьтесь на наконечнике. Как только пипетка окажется в ванне, подайте положительное давление через систему контроля обратного давления.
Подойдите к интересующей точке под визуальным контролем, сохраняя при этом противодавление в пипетке. При появлении небольшой ямочки на поверхности клетки сбросьте давление. На этом этапе может образоваться герметичное уплотнение с сопротивлением более 1 гигаом. В противном случае приложите легкое отрицательное давление, чтобы облегчить это.
Пока уплотнение формируется, доведите удерживающее напряжение-зажим до минус 60 милливольт. Как только гигаомное уплотнение будет сформировано, примените импульс всасывания, чтобы разорвать клеточную мембрану и перейти в режим полноклеточного уплотнения. Как только он перейдет в режим работы со всей ячейкой, переключитесь с напряжения на режим токового клеща и начните запись.