Неинвазивный подход к изучению электрофизиологии двигательных нейронов у эмбрионов рыбок данио

Поместите генетически модифицированные эмбрионы рыбок данио под стереомикроскоп и понаблюдайте за спонтанным скручиванием хвоста, вызванным двигательными нейронами спинного мозга.

Внутренние свойства этих нейронов вызывают приток ионов через натриевые каналы, что приводит к спонтанной деполяризации мембраны и генерации потенциалов действия, которые распространяются на мышцы, вызывая скручивание хвоста. Измерьте частоту намотки.

Перенесите некоторые эмбрионы в блокатор натриевых каналов, чтобы подавить приток натрия и оценить сниженную частоту скручивания.

Поместите необработанные эмбрионы в расплавленную агарозу; дайте агарозе застыть, чтобы ограничить движение, и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом.

Моторные нейроны экспрессируют биосенсор с мембранным потенциал-чувствительным доменом, или VSD, слитым с донорными и акцепторными флуорофорами.

Деполяризация изменяет конформацию ДМЖ, сближая флуорофоры.

При возбуждении донор передает энергию акцептору, вызывая излучение акцепторной флуоресценции.

Добавьте блокатор для ингибирования деполяризации, которая снижает эмиссию акцептора, подтверждая блокатор-опосредованное ингибирование спонтанной деполяризации в нейронах.

Для анализа спонтанного скручивания хвоста перенесите эмбрионы в 90-миллиметровую круглую чашку Петри, наполненную рыбьей водой, содержащей 0,2% ДМСО, и вручную дехорионизируйте их с помощью двух ювелирных щипцов с острыми кончиками или иглами. После этого инкубируйте эмбрионы в течение 5 минут при температуре 28 градусов Цельсия. С помощью цифровой камеры, установленной на стереомикроскопе, обнаружить скручивание хвоста при комнатной температуре во время минутной видеозаписи.

Далее получите временной ряд с временным разрешением 30 кадров в секунду. Затем рассчитайте частоту спонтанного скручивания хвоста, подсчитав количество изгибов в единицу времени. Чтобы оценить действие препарата рилузол, перенесите эмбрионы в новую 90-миллиметровую чашку Петри, наполненную рыбьей водой, содержащей 5 микромоляров рилузола. Затем инкубируйте эмбрионы в течение 5 минут при температуре 28 градусов Цельсия, прежде чем записать минутное видео и провести поведенческий анализ.

Теперь поместите от 20 до 24 эмбрионов HPF в агарозу с низкой температурой плавления 1% в рыбью воду в 35-миллиметровую чашку со стеклянным дном при температуре 37 градусов Цельсия. Расположите зародыши на бок и подождите, пока агароза застынет при комнатной температуре.

Далее перенесите чашку для визуализации на столик конфокального микроскопа. Идентификация моторных нейронов, экспрессирующих биосенсор, путем возбуждения мономера Умикиноко-Грин с помощью аргонового лазера с интенсивностью 488 нанометров. Затем установите его излучение в диапазоне от 495 до 525 нанометров и нажмите Record.

Для измерения FRET возбуждайте mUKG, донора FRET в паре с 488-нанометровым лазером. Одновременно, используя два фотоумножителя, детектировать флуоресценцию, излучаемую донором, и флуоресценцию, излучаемую мономерным акцептором Кусабира-Оранж. В начале эксперимента оптимизируйте усиление и смещение фотоумножителя 1, в котором регистрируется флуоресценция mUKG, и поддерживайте их постоянными на протяжении всего сеанса.

Чтобы задать смещение, измените цвет изображения на значения интенсивности с помощью таблицы Q-lookup. При сканировании с выключенным лазером используйте ползунок смещения, чтобы интенсивность пикселей фона была немного выше нуля. Используя ту же таблицу поиска, включите лазер. Во время сканирования используйте ползунок усиления, чтобы максимизировать соотношение сигнал/шум, стараясь избегать насыщенных пикселей.

В окне получения программного обеспечения выберите режим сбора данных xyt и размер поля изображения 512 на 64 пикселя из раскрывающегося меню. Затем настройте запись изменений напряжения спинномозговых нейронов эмбриона так, чтобы получать одну плоскость xy каждые 30 миллисекунд в течение одной минуты. Оцените влияние введения рилузола на деполяризацию мембраны в том же нейроне, получите новый набор данных через пять минут после добавления рыбьей воды, содержащей 5 микромолярных рилузолов.