Электрофизиологическая регистрация реакций напряжения фоторецепторов сетчатки дрозофилы на световые стимулы

Посадите муху дрозофилы на держатель с открытой головой.

Создайте отверстие в одном глазу и удалите роговицу, чтобы обнажить сетчатку.

Поместите держатель на платформу для записи.

Вставьте тупой электрод сравнения, содержащий физиологический раствор, в капсулу головы.

Затем вставьте острый записывающий электрод, содержащий раствор, имитирующий внутриклеточную среду, через отверстие в сетчатку.

Дайте глазу адаптироваться к темноте.

Измерьте сопротивление записывающего электрода, чтобы убедиться в его пригодности для записи.

Затем устраните базовую разность напряжений между записывающим электродом и электродом сравнения.

Во время адаптации к темноте определенные ионные каналы в фоторецепторных клетках сетчатки остаются открытыми, что обеспечивает устойчивый положительный приток ионов.

Стимулируйте глаз с помощью световых вспышек.

В ответ ионные каналы закрываются, уменьшая приток положительных ионов и способствуя оттоку.

Следовательно, мембранный потенциал фоторецепторов становится более отрицательным, измеряемым записывающим электродом как падение напряжения.

При работе с микроэлектродным усилителем всегда заземляйте, прикасаясь к металлической поверхности клетки Фарадея или антивибрационного стола для предотвращения статических зарядов. Закрепите установленную ширинку на столбе платформы для подготовки мух.

Поверните держатель мухи так, чтобы левый глаз мухи был обращен прямо к исследователю. Затем с помощью маленького грубого микроманипулятора аккуратно вставьте тупой электрод сравнения через глазки мухи в капсулу головки. Убедитесь, что муха все еще выглядит здоровой и двигает своими усиками. Подготовка должна быть превосходной, чтобы заслуживать записи.

Теперь введите острый записывающий микроэлектрод в левый глаз через отверстие, покрытое желеобразным покрытием. Когда он попадает в ткань, расположение кончика электрода должно быть видно по его отражательной способности. Хрупкий кончик электрода должен быть идеально направлен, иначе он сломается, что очень сложно.

В зависимости от типа регистрируемой клетки, голова мухи должна быть ориентирована немного по-разному. Установив электроды на место, включите микроэлектродный усилитель. Затем выключите источник холодного света, отключите его от сети и подключите к центральному заземлению, чтобы свести к минимуму электрический шум, вызванный контуром заземления.

Затем отрегулируйте световоды на гусиной шее так, чтобы система карданных рычагов могла свободно перемещаться вокруг ширинки. Затем выключите свет в комнате, чтобы поместить подготовку к мухам в относительную темноту. Теперь измерьте сопротивление записывающего электрода в глазу. Она должна быть в диапазоне от 100 до 250 мегаом.

Далее установите усилитель на токовый клещи или мост и обнулите напряжение между электродами. После того как муха приспособится к темноте в течение нескольких минут, введите наконечник записывающего электрода в глаз с шагом от 0,1 до 1 микрона с помощью пьезошагового инструмента или с помощью мягкого вращения ручки с высоким разрешением.

На каждом шаге стимулируйте глаз световой вспышкой продолжительностью от 1 до 10 миллисекунд. Каждая световая вспышка вызовет кратковременное падение напряжения или ЭРГ.