Мониторинг электрических сигналов от афферентных нейронов у обездвиженной личинки данио-рерио

Начните с обездвиженной, парализованной личинки данио-рерио в записывающей камере, заполненной внеклеточным раствором в электрофизиологической установке.

Заполните афферентную микропипетку внеклеточным раствором, содержащим ионы, которые обеспечивают электропроводность для регистрации активности нейронов.

Соберите его в микроманипулятор, содержащий записывающий электрод, подключенный к усилителю для записи сигнала.

Применяйте положительное давление воздуха, чтобы предотвратить засорение пипетки.

Переместите кончик пипетки вдоль нерва боковой линии и расположите его рядом с афферентным ганглием, который содержит скопление тел афферентных нейронных клеток.

Клеточные процессы этих нейронов связаны с волосковыми клетками, расположенными вдоль боковой линии, которые ощущают движения воды.

Затем приложите мягкое отрицательное давление, чтобы образовалось слабое уплотнение между микропипеткой и афферентным ганглием.

Запишите электрические сигналы от афферентных нейронов, которые получают сенсорный сигнал от волосковых клеток обездвиженной личинки.

Обездвижьте личинок данио-рерио и перенесите их в 35-миллиметровую чашку Петри с помощью переводной пипетки с большим наконечником. Удалите как можно больше окружающего раствора. Погрузите личинок в 10 микролитров 0,1% альфа-бунгаротоксина примерно на пять минут. Промойте парализованную личинку внеклеточным раствором в течение 10 минут. Затем с помощью переводной пипетки переместите личинку из ванны с внеклеточным раствором в записывающую чашку с силиконовым дном.

Под стереомикроскопом аккуратно расположите личинки с помощью щипцов с тонкими наконечниками над центром силиконового коврика, боковой стороной вверх, при этом передний и задний концы тела проходят слева направо. С помощью щипцов с тонкими наконечниками вставьте протравленный штифт перпендикулярно силикону через дорсальную хорду личинок, непосредственно дорсально к анальному отверстию. Вставьте второй штифт через хорду возле конца хвоста, а третий штифт вставьте через хорду дорсального отдела газового пузыря. Вставьте четвертый штифт через глазную пузырьку, обеспечивая при этом небольшое вращение, когда штифт вставляется в инкапсулятор.

При незначительном вращении следите за тем, чтобы ткань между клейтрумом и глазным пузырем показала скопление афферентной соматы. Поместите прикрепленную лаву под объектив с 10-кратным увеличением на неподвижный предметный столик микроскопа DIC и расположите миосептальные щели мышечных блоков параллельно вектору левой головной стадии.

Поместите провод заземления в раствор для ванны и убедитесь, что он подключен к левой головной сцене. Наполните афферентный регистрирующий электрод 30 микролитрами внеклеточного раствора и вставьте его в правый держатель пипетки на ступице головки. Затем опустите его в раствор для чашки, оказывая положительное давление, создаваемое пневматическим преобразователем.

Найдите электрод и наведите кончик электрода на образец. С помощью микроманипулятора опустите афферентный кончик электрода до тех пор, пока он не окажется над клейтрумом. Увеличьте увеличение до 40-кратного погружения и найдите место пересечения задней боковой линии нерва и клейтрума. Подведите наконечник электрода к афферентному ганглию и опустите пипетку до тех пор, пока наконечник не соприкоснется с эпителием. Аккуратно маневрируйте электродом так, чтобы вся окружность кончика соприкасалась с афферентным ганглием.