Одновременный оптический и электрофизиологический мониторинг нейронных клеток в срезах мозга

Начните с перфузии аэрированной искусственной спинномозговой жидкости или аКСФ над сеткой в перфузионной камере.

Перенесите срез мозга, содержащий нейроны, экспрессирующие флуоресцентные белки, и закрепите его с помощью платинового устройства.

Поверните сетку сетки для выравнивания.

Опустите многоканальный щуп по направлению к срезу.

Отрегулируйте кубик фильтра для визуализации флуоресцентного белка.

Поверните срез, чтобы выровнять щуп.

Отрегулируйте высоту зонда ниже поверхности ткани.

Теперь выполните перфузию aCSF и сосредоточьтесь на флуоресцентно помеченных нейронах.

Используя объектив высокой мощности, сфокусируйтесь на ткани и отрегулируйте возбуждающий свет.

Используйте соответствующий световой фильтр для наблюдения за флуоресценцией в нейронах.

Отрегулируйте линзу объектива, чтобы освободить место для патч-пипетки, и надавите на нее.

Затем расположите пипетку рядом с нейроном, чтобы образовалась мембранная ямочка.

Наконец, примените слабое всасывание для создания уплотнения мембраны, а затем сильное всасывание для разрыва мембраны и получения электрических записей от целевого нейрона.

Чтобы поместить многоканальный зонд в предметное стекло ткани мозга ex vivo, перфузируйте экспериментальный ACSF со скоростью от трех до шести миллилитров в минуту и перенесите срез мозга, содержащий интересующую область, на сетку в перфузионной камере микроскопа. Закрепите срез мозга с помощью платиновой арфы. Поверните сетку сетки так, чтобы линия контактов электродов на дистальном конце многоканального зонда была примерно перпендикулярна поверхности PL.

При широкопольном освещении и точном контроле микроманипулятора опустите многоканальный зонд к поверхности среза. Задействуйте соответствующий фильтрующий куб для визуализации флуоресцентного репортерного белка, экспрессируемого в окончаниях аксонов корковых афферентов.

При необходимости поверните срез, чтобы более точно выровнять щуп с поверхностью PL. Расположите зонд чуть выше плоскости среза, на расстоянии 200 микрометров от конечного целевого положения по оси x, оставив по крайней мере один канал за пределами регистрируемой области ткани. Медленно введите щуп в срез вдоль его продольной оси.

Чтобы свести к минимуму повреждение тканей, продвигайте зонд только до такой степени, чтобы острые кончики были видны только ниже поверхности ткани. Переключите экспериментальный источник ACSF на контрольный раствор в мешке и определите флуоресцентно меченую ячейку для целевой записи с помощью патч-клэмпа. Ограничьте диафрагму до наименьшего диаметра и задействуйте мощный погружной объектив с высокой мощностью, стараясь избегать контакта между многоканальным датчиком и линзой объектива. Сосредоточьтесь на ткани.

Центрируйте свет на участке ткани, прилегающем к многоканальному зонду, но не перекрывающем его. Используйте соответствующий набор фильтров, чтобы обеспечить визуализацию клеток, экспрессирующих Cre-зависимый флуоресцентный маркер. Поднимите линзу объектива, чтобы освободить достаточно места для опускания патч-пипетки.

Загрузите патч-пипетку с внутренним раствором и установите на держатель электрода. С помощью одномиллилитрового шприца надавите положительным давлением, соответствующим примерно 0,1 миллилитра воздуха. Опустите патч-пипетку в раствор, сфокусировав наконечник под визуальным контролем, и получите запись всей клетки из целевой клетки.