Определение влияния тестового гормона роста на нейроны кисспептина с помощью цельноклеточного зажима

Закрепите трансгенный срез гипоталамуса мыши в записывающей камере, перфузированной с аКСФ.

Срез содержит флуоресцентные нейроны кисспептина, экспрессирующие белок слияния, которые имеют решающее значение для регуляции репродуктивной системы.

Соберите микропипетку, состоящую из записывающего электрода, во внутреннем растворе.

Микроскопическое определение местоположения флуоресцентного кисспептинового нейрона.

Надавите на пипетку и продвигайте ее к целевому нейрону. При контакте давление создает углубление на мембране нейрона.

Приложите кратковременное отрицательное давление, образуя высокопрочное уплотнение между микропипеткой и мембраной.

Установите удерживающее напряжение на физиологический потенциал покоя нейрона для точных измерений.

Применяйте короткие импульсы отрицательного давления, чтобы разорвать мембрану, создавая конфигурацию всей клетки.

Подтвердите жизнеспособность нейрона, отслеживая параметры.

Введите тестовый гормон роста, запускающий сигнальные пути и вызывающий изменения мембранного потенциала нейрона.

Измерьте изменения мембранного потенциала, чтобы определить ингибиторное влияние гормона роста на активность нейронов.

Переносите интересующий вас срез мозга по одному в записывающую камеру с помощью акриловой пипетки. Удерживайте срез анкером для среза, чтобы он не двигался во время перфузии aCSF. Расположите срез к центру записывающей камеры с помощью маломощной линзы объектива иммерсионного микроскопа в 10 или 20 крат.

Положение среза имеет решающее значение для обеспечения хорошего обзора нужной области под микроскопом и для идеальной досягаемости записывающей микропипетки. После определения местоположения интересующей области переключите линзу объектива на линзу высокой мощности, 63x, и сосредоточьтесь на уровне ткани, наблюдая за эндогенным флуоресцентным белком и формами клеток в целевой области, чтобы найти клетки кисспептина на поверхности среза мозга.

Когда возможная целевая ячейка найдена, отметьте ее на экране компьютера курсором мыши или нарисовав над интересующей областью формат, например, квадрат. Отмеченный экран компьютера помогает направлять микропипетку к ячейке. После определения точного местоположения целевой ячейки поднимите объектив и введите записывающую микропипетку, наполненную внутренним раствором, в держатель электрода, убедившись, что внутренний раствор находится в контакте с серебряным электродом.

Перед погружением микропипетки в раствор aCSF с помощью наполненного воздухом шприца объемом от 1 до 3 миллилитров, подключенного к держателю микропипетки через полиэтиленовую трубку, подайте положительное давление, чтобы предотвратить попадание мусора внутрь микропипетки. С помощью микроманипулятора направьте микропипетку ниже центра объектива. Переместите кнопки микроманипулятора, чтобы направить оси X, Y, Z микропипетки к интересующей ячейке.

Отрегулируйте фокус так, чтобы был виден кончик микропипетки, и приблизьте фокус к срезу, но не слишком близко к нему. Уменьшите скорость микроманипулятора и медленно опустите микропипетку в плоскость фокусировки, следя за тем, чтобы кончик микропипетки не проникал резко в срез, а медленно опускался до тех пор, пока не коснется поверхности клетки или целевой области.

Применяя легкое положительное давление с помощью наполненного воздухом шприца объемом от 1 до 3 миллилитров, чтобы удалить любой мусор с пути приближения, медленно перемещайте микроманипулятор по осям x, y, z, чтобы приблизить наконечник микропипетки и коснуться целевой клетки, что вызывает ямочку при приложенном давлении. После создания углубления, с помощью режима зажима напряжения в программном обеспечении, примените слабое кратковременное всасывание ртом в течение 1-2 секунд через трубку, подключенную к держателю микропипетки, чтобы создать уплотнение между микропипеткой и клеткой.

Если уплотнение остается механически устойчивым без шумовых помех в течение примерно минуты, установите удерживающее напряжение на ближайший физиологический потенциал покоя интересующей клетки. Для нейронов кисспептина гипоталамуса рекомендуется минус 50 милливольт. Затем примените кратковременное отсасывание через рот, чтобы разорвать плазматическую мембрану на кончике микропипетки, припаянном к клетке, чтобы разорванная мембрана не закупорила микропипетку и не притянула значительную часть мембраны или клетки.

Адекватная конфигурация целых ячеек может быть достигнута путем выполнения всасывания с достаточной силой. Проверьте используемое руководство по настройкам системы. После разрыва клеточной мембраны включите опцию «Вся ячейка» в режиме зажима напряжения и нажмите на команду auto, ссылаясь на вкладку «Вся ячейка».

Далее проверьте параметры жизнеспособности клеток в программном обеспечении, как описано в текстовой рукописи. Контролируйте сопротивление последовательности и установившуюся емкость ячеек во время экспериментов. После того, как конфигурация всей ячейки будет правильно достигнута, измерьте синаптические токи в режиме напряжения-зажима. Регистрация изменений потенциала мембраны покоя и изменения потенциала индуцированной мембраны покоя в режиме текущего зажима.