Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:14 мин. • July 8th, 2025
Возьмите иммобилизованный генетически модифицированный корональный срез мыши в записывающей камере, перфузированной кислородосодержащим буфером.
Срез содержит полосатую область, в которой находятся интернейроны, перепрограммированные из клеток-предшественников олигодендроцитов, отмеченных маркером интернейронов и экспрессией флуоресцентных белков.
Соберите записывающую пипетку, состоящую из электрода, погруженного во внутриклеточный раствор.
Микроскопически идентифицируют флуоресцентный интернейрон.
Поддерживайте положительное давление в пипетке и продвигайте ее к целевому интернейрону, контактируя с мембраной.
Приложите отрицательное давление, чтобы сформировать высокопрочное уплотнение.
Применяйте импульсы отрицательного давления, чтобы разорвать мембрану, создавая конфигурацию всей клетки.
Поддерживать мембранный потенциал интернейрона на постоянном отрицательном уровне.
Применяйте кратковременные инкрементальные токи, открывая ионные каналы и изменяя мембранный потенциал, запуская потенциал действия.
В конце концов, мембрана возвращается к потенциалу покоя.
Наблюдайте за этими изменениями мембранного потенциала в ответ на текущую инъекцию, указывающие на созревание нейронов и успешное перепрограммирование.
После переноса одного среза ткани в регистрирующую камеру для электрофизиологии установите стеклянную пипетку на записывающий электрод и опустите ее в раствор. Перепроверьте сопротивление электрода. Затем медленно подойдите к перепрограммированной ячейке с помощью пипетки, сохраняя небольшое положительное давление в электроде, чтобы избежать закупорки наконечника, и убедитесь, что ячейка GFP-положительна, прежде чем устанавливать коммутацию.
Когда ячейка залатана, поддерживайте ячейку в токовом зажиме от минус 60 до минус 70 милливольт и подавайте 500-миллисекундные токи от минус 20 до плюс 90 пикоампер с шагом 10 пикоампер для индуцирования потенциалов действия. Это свидетельствует о созревании нейронов и успешном перепрограммировании.