Запись цельноклеточного патч-зажима в нейроне желатиновой субстанции среза спинного мозга

Поместите срез спинного мозга крысы в записывающую камеру и закрепите его тканевым анкером.

Перфузируйте срез искусственной спинномозговой жидкостью.

Под микроскопом определите полупрозрачную желатинозную субстанцию или SG-область и выберите здоровый SG-нейрон.

Расположите рядом с нейроном патч-пипетку, наполненную ионным раствором.

Приложите легкое положительное давление, чтобы удалить мусор с наконечника пипетки.

Переместите пипетку по направлению к нейрону.

Затем ослабьте положительное давление, чтобы сформировать ямочку на мембране нейрона, создав уплотнение.

Измените удерживающий потенциал, чтобы приблизить его к мембранному потенциалу покоя, или RMP.

Используйте кратковременное отсасывание, чтобы разорвать мембрану, создав конфигурацию всей клетки.

При RMP подайте деполяризующие электрические импульсы.

Эти импульсы открывают потенциал-зависимые натриевые каналы, обеспечивая быстрый приток ионов натрия.

Этот приток ионов запускает потенциал действия, что приводит к возбуждению нейронов.

Запишите паттерны возбуждения нейронов.

Для проведения полноклеточной патч-зажимной записи с нейронов субстанции желатинозы или SG для регистрации используют внутриклеточные растворы на основе ионов калия, в то время как раствор на основе катионов цезия применяется только для регистрации тормозных постсинаптических токов.

Аккуратно переместите срез спинного мозга к записывающей камере, а затем прочно стабилизируйте его с помощью U-образной платиновой проволоки с нейлоновыми нитями для оптимальной стабильности среза. Постоянно перфузируйте ломтик пузырьковым ACSF при комнатной температуре и установите скорость перфузии на уровне от 2 до 4 миллилитров в минуту для достижения достаточного насыщения кислородом.

Затем, используя линзу микроскопа с низким разрешением, определите область нейронов SG как полупрозрачную полосу. Выберите в качестве целевой клетки здоровый нейрон, характеризующийся трехмерной формой с яркой и гладкой мембраной, с помощью объектива с высоким разрешением, и отрегулируйте его по центру экрана видеомонитора.

Наполните микропипетку соответствующим объемом внутриклеточного раствора на основе ионов калия или цезия-ионов. Затем вставьте микропипетку в держатель электродов и убедитесь, что внутриклеточный раствор контактирует с серебряной проволокой внутри держателя. Сфокусируйте микропипетку и с помощью микроманипулятора погрузите ее в ACSF. Приложите легкое положительное давление, чтобы удалить грязь и мусор.

Постепенно перемещайте микропипетку по направлению к целевому нейрону. Как только пипетка приблизится к нейрону и на мембране нейрона образуется очень маленькая ямочка, сбросьте положительное давление, чтобы сформировать гигауплотнение. Измените удерживающий потенциал до минус 70 милливольт, что близко к физиологическому потенциалу мембраны покоя клетки.

Затем примените переходное и мягкое всасывание к микропипетке, чтобы разорвать мембрану и создать хорошую конфигурацию всей клетки. Регистрируйте свойства возбуждения, проверяя характер возбуждения каждого нейрона в токовом зажиме с помощью серии односекундных импульсов деполяризующего тока от 25 до 150 пикоампер с шагом 25 пикоампер при мембранном потенциале покоя.