Вызванные светом постсинаптические реакции в нейронах срезов сетчатки мыши

Возьмите адаптированный к темноте срез сетчатки мыши в записывающей камере в темной комнате. Сетчатка сидит на поддерживающей искусственной основе, установленной поверх покровной пластины. Перфузируйте ломтик с помощью aCSF.

Нейронная сеть сетчатки включает фоторецепторы, синаптически связанные с биполярными клетками, которые синаптически связаны с ганглиозными клетками.

Расположите записывающую пипетку рядом с сетчаткой.

Под микроскопом приложите положительное давление при приближении к целевой ганглиозной клетке.

Переключитесь на отрицательное давление, чтобы втянуть мембранный пластырь, затем разорвите его, чтобы обеспечить непрерывность с цитоплазмой.

В темноте мембрана фоторецептора остается деполяризованной, что приводит к высвобождению нейромедиаторов.

Нейротрансмиттеры, связывающиеся с рецепторами биполярных клеток, запускают закрытие катионных каналов, препятствуя передаче сигнала.

Подайте световой импульс для гиперполяризации фоторецепторов. Снижение высвобождения нейротрансмиттеров запускает открытие катионных каналов в биполярных клетках.

Приток катионов индуцирует высвобождение нейротрансмиттеров, которые связываются с рецепторами ганглиозных клеток, генерируя возбуждающий постсинаптический потенциал, регистрируемый пипеткой.

Для записи с патч-зажимом загрунтуйте перфузионные трубки средой Эймса и дайте всем пузырькам выйти из трубки. После изготовления записывающих пипеток стеклянным пуллером засыпьте наконечник раствором пипетки. Затем с помощью наполнителя микропипетки заполните примерно одну треть пипетки. После заполнения храните каждую пипетку во влажной коробке для пипетки.

Далее включите оборудование для патч-фиксации, включая компьютер, усилитель, ПЗС-камеру и микроскоп. Работая в темных условиях, препарат среза сетчатки помещают на предметный столик микроскопа с помощью инфракрасного зрителя. После того, как он будет обездвижен, начинают непрерывную перфузию.

Установите температуру перфузии на уровне от 33 до 37 градусов по Цельсию. Просмотрите поверхность среза с помощью ПЗС-камеры. Сосредоточьтесь на целевом местоположении, где находятся целевые типы клеток. Выберите здоровую ячейку для записи патч-хомута. Как только здоровая клетка будет идентифицирована, поместите записывающую пипетку в держатель для пипетки и перейдите к подготовке среза.

Когда он приблизится к подготовке среза, найдите кончик пипетки с помощью микроскопа. Как только наконечник пипетки станет виден под микроскопом, переместите наконечник вниз по направлению к целевой клетке. Далее установите усилитель, и отрегулируйте пипетку на пикоампер 5 вольт на наноампер. Запустите два непрерывных электрических импульса примерно 5 милливольт и примерно 10 герц и проверьте сопротивление пипетки.

Идеальное сопротивление составляет от 5 до 12 мегаОм для большинства нейронов сетчатки. Когда все будет готово, используйте мундштук или шприц для выдувания внутреннего раствора, пока кончик пипетки не окажется на поверхности целевой клетки. Когда положительное давление сделает небольшую ямочку на поверхности клетки, немного придвиньте кончик вперед и прекратите выдувание.

Если сопротивление пипетки постоянно увеличивается, оставьте его и следите за сопротивлением, пока оно не достигнет более 1 гигаом. Если сопротивление самопроизвольно не увеличивается, осторожно приложите отрицательное давление, пока оно не станет гигауплотнением. После того, как гигауплотнение будет достигнуто, измените удерживающий потенциал на отрицательные 70 милливольт.

Затем периодически прикладывайте отрицательное давление, чтобы разорвать мембрану внутри наконечника пипетки. При использовании цельноэлементной конфигурации сопротивление пипетки может составлять от 500 МОм до одного гигаОма, а емкостный ток можно наблюдать. Запишите зависимость ВАХ от отрицательных 80 до 40 милливольт. В зависимости от типа ячейки будут активированы различные типы потенциал-зависимых каналов. Наконец, запишите вызванные светом синаптические токи или напряжения.