Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:18 мин. • July 8th, 2025
Начните с рассеченной мышиной ушной раковины, или наружного уха, с обнаженными соединенными нервами.
Вставьте нерв, предназначенный для записи, в записывающий электрод.
Удалите жировой слой возле края ушной раковины, чтобы обнажить основание волосяного фолликула, затем сложите кожу, чтобы обнажить волоски для стимуляции.
Расположите щуп механической стимуляции так, чтобы касаться и отклонять волоски.
Эта стимуляция активирует чувствительные нервные окончания, открывает механически затворенные ионные каналы, обеспечивает положительный приток ионов и генерирует потенциалы действия.
Потенциалы действия распространяются через эти окончания к регистрируемому нерву. Визуализируйте сигнал.
Далее добавьте флуоресцентный краситель и продолжайте стимуляцию волос.
Краситель связывается со стимулированными мембранами нейронов и интернализуется посредством эндоцитоза, не влияя на активность нейронов.
После стимуляции промойте для удаления несвязанного красителя.
Добавьте секвестрирующий агент для удаления неинтернализованного красителя, связанного с мембраной.
С помощью флуоресцентной микроскопии визуализируйте окрашивание волосяных фолликулов, чтобы выявить механически стимулированные нервные окончания.
Для контролируемой регистрации потенциалов действия, вызванных стимулом, используется механический зонд из полированного огнем 10-сантиметрового боросиликатного микроэлектродного стекла, прикрепленный к керамическому пьезоэлектрическому приводу. Расположите зонд так, чтобы он двигался параллельно кожной складке и касался волосков, а не кожи. Поместите его примерно на пол-один миллиметр над поверхностью кожи. Затем вручную проверьте стимуляцию, прослушивая аудиовыход при движении зонда.
Теперь настройте программное обеспечение для механической стимуляции небольшого участка волос. Например, программируйте трехсекундную стимуляцию на пяти синусоидах Герц каждые 10 секунд. Для этого требуется смещение зонда от 200 до 2000 микрон. Затем продолжайте использовать повторную автоматическую стимуляцию, чтобы проверить согласованность записанных реакций в нервах. Воспроизводимые результаты должны быть достижимыми.
Когда результаты будут стабильными, уменьшите частоту повторов до 30 секунд. Дальнейшие инструкции приведены в текстовом протоколе. Чтобы исследовать свойства механосенсорных каналов и пометить механосенсорные терминали вокруг волосяных фолликулов, добавьте в раствор 10 микромоляров FM143 и оставьте на 60 минут, продолжая стимулировать волоски осциллирующим зондом.
Этот краситель блокирует потенциальные каналы преобразователя в сенсорных нейронах в культуре и в волосковых клетках улитки. Тем не менее, он не блокирует возбуждение в зрелых волосяных фолликулах афферентов in situ. Маркировка окончаний показывает, что краситель действует как терминалы, которые продолжают реагировать на механическую стимуляцию на протяжении всего воздействия красителя.