JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:11 мин • July 8th, 2025
Поместите чашку Петри, содержащую расчлененную личинку дрозофилы с обнаженными мышцами и нервными ветвями, на предметный столик микроскопа.
Вставьте электрод сравнения в раствор ванны в чашке Петри.
Заполните записывающий электрод изотоническим раствором.
С помощью микроманипулятора расположите этот электрод над мышцей живота, иннервируемой моторными нейронами.
Поместите наконечник электрода на синаптический бутон, структуру на кончике аксона, содержащую нейротрансмиттеры.
Непрерывно регистрируйте миниатюрные возбуждающие соединительные токи или mEJC, которые являются реакцией на спонтанное высвобождение нейротрансмиттеров.
Правильный диапазон амплитуды mEJC подтверждает правильное положение электрода.
Затем расположите электрод стимуляции рядом с аксоном, который иннервирует целевую мышцу.
Приложите отрицательное давление, чтобы втянуть аксон внутрь электрода.
Постепенно увеличивайте ток стимуляции, чтобы вызвать потенциал действия.
Это заставляет аксон высвобождать нейротрансмиттеры в нервно-мышечном соединении, которые записываются как синаптические токи.
Поставьте чашку Петри с препаратом на предметный столик для микроскопа. Вставьте электрод сравнения в ванну. Заполните записывающий электрод раствором HL3. Под объективом 10x погрузите электрод в ванну и поместите его на мышцы шестого и седьмого сегментов брюшной полости 2, 3 или 4 с помощью микроманипулятора.
Затем переключите объектив на 60X и сфокусируйтесь на интересующей вас области с помощью эпифлоресценции или оптики DIC. Поместите кончик электрода поверх синаптических бутонов, затем очень осторожно надавите на мышцу, так как чрезмерное давление может повредить NMJ или вызвать увеличение спонтанной синаптической активности.
Далее включите усилитель, плату АЦП и компьютер. Затем выберите режим зажима напряжения на усилителе. Запустите программное обеспечение для сбора данных, выберите режим Gap-free и наблюдайте за внешним видом mEJC на экране компьютера. Убедитесь, что амплитуда mEJC находится в диапазоне от 0,2 до 0,7 наноампер.
С помощью микроманипулятора под визуальным контролем поместите электрод стимуляции рядом с аксоном, иннервирующим брюшные сегменты со 2 по 4. Приложите отрицательное давление, потянув за поршень шприца, подключенного к держателю электрода, так, чтобы аксон был втянут внутрь электрода.
Далее включаем стимулятор. Поверните ручку на блоке изоляции, чтобы установить нулевой ток, а затем плавно увеличивайте его до появления ЕЕК или до достижения порога. Проводите стимуляцию в надпороговом режиме, при этом ток стимуляции увеличивается примерно в два раза по сравнению с пороговым значением для наблюдения ЕЕК.