Создание целоклеточного зажима для электрофизиологической записи с вомероназальных сенсорных нейронов

Возьмем корональный срез хемосенсорного вомероназального органа у трансгенной мыши, экспрессирующей флуоресцентно меченые сенсорные нейроны.

Сенсорный эпителий содержит эти меченые нейроны, которые подвергаются воздействию просвета, соединенного с носовой полостью для восприятия химических сигналов.

Закрепите срез в камере визуализации с помощью анкера для среза.

Переведите камеру в записывающую установку и влейте насыщенный кислородом внеклеточный раствор для поддержания жизнеспособности тканей.

Расположите перфузионную пипетку рядом со срезом, чтобы ввести химические стимулы, и записывающую пипетку над сенсорными нейронами.

С помощью флуоресцентного микроскопа определите помеченные нейроны.

Приложите положительное давление, чтобы предотвратить засорение пипетки, и приближайтесь к нейрону до тех пор, пока на мембране не образуется ямочка.

Переключитесь на отрицательное давление, втягивая мембрану в пипетку.

Применяйте всасывание для разрыва мембраны и установления непрерывности с цитоплазмой, называемое цельноклеточным зажимом, что позволяет вводить химические стимулы и записывать полученные электрофизиологические сигналы.

Перенесите срез VNO в камеру визуализации и зафиксируйте положение среза с помощью анкера из нержавеющей стали, проволоченного синтетическими волокнами толщиной 0,1 мм. Не закрывайте срез ткани нитями синтетического волокна. Затем перенесите камеру визуализации в записывающую установку и непрерывно переливайте срез с кислородом S2 при комнатной температуре.

Отрегулируйте всасывающий капилляр к поверхности раствора, чтобы создать постоянный обмен раствора для ванны. Затем отрегулируйте многоствольный перфузионный карандаш 8-в-1 выше и ближе к несенсорной части среза VNO, которая содержит кровеносный сосуд. После этого соедините электрод сравнения и раствор ванны с помощью L-образного агарового моста, заполненного 150 миллимолярным хлоридом калия.

Впоследствии заполните патч-пипетку раствором пипетки S4. Установите пипетку на электрод с покрытием из хлорида серебра, подключенный к головному столику, не соскребая покрытие, и надежно закрепите. Затем слегка надавите на пипетку перед входом в ванну. Следите за работой пипетки и убедитесь, что она находится в диапазоне от четырех до 10 мегаом.

Визуализируйте срез VNO с помощью ПЗС-камеры с использованием оптимизированного инфракрасного диапазона DIC, и определите клетки, экспрессирующие FPR-rs3-i-Venus, или аналогично помеченные нейроны с помощью флуоресцентного освещения и соответствующего куба фильтра. Подойдите к корпусу клетки с помощью маховиков для максимальной чувствительности. Из-за положительного давления становится заметной небольшая вмятина на мембране клеточной сомы, как только наконечник пипетки находится в непосредственной близости.

Затем отпустите положительное давление и приложите небольшое отрицательное давление, чтобы всасывать клеточную мембрану, чтобы получить уплотнение с высоким сопротивлением от 1 до 20 гигаом. Затем примените короткое и мягкое отсасывание, чтобы разрушить клеточную мембрану и создать конфигурацию всей клетки.