Одновременное измерение внутриклеточного кальция и мембранного потенциала в эндотелии головного мозга мыши

Возьмите сегменты задней мозговой артерии мыши.

Инкубируйте с ферментным раствором, чтобы разрушить тканевый матрикс, разрыхлив клетки.

Замените раствор буфером, затем перенесите сегмент в записывающую камеру.

Механически диссоциировать клеточные слои соединительной ткани и гладкомышечной ткани, изолируя нижележащую эндотелиальную трубку.

Закрепите трубку, удалите диссоциированные слои и добавьте физиологический буфер.

Поместите камеру в записывающую систему с непрерывным буферным потоком.

Введите флуоресцентный индикатор кальция, который поступает в эндотелиальные клетки, затем вставьте в клетку записывающий электрод.

Введите препарат, который вызывает приток ионов кальция и индуцирует нисходящую передачу сигналов для высвобождения кальция из эндоплазматического ретикулума.

Индикатор связывается с кальцием и при возбуждении излучает флуоресценцию.

Увеличение кальция активирует кальций-зависимые калиевые каналы, вызывая отток калия и изменяя мембранный потенциал.

Одновременно регистрируйте изменения внутриклеточного кальция с помощью флуоресцентного сигнала и мембранного потенциала с помощью электрода.

В этой процедуре подготавливают аппарат для растирания с помощью микроскопа, камеры и алюминиевого предметного столика, удерживающего камеру и микроманипуляторы. Закрепите микрошприц с контроллером насоса рядом со столиком и образцом. Далее полностью заполните пипетку растирания минеральным маслом и закрепите ее над поршнем микрошприца.

Затем с помощью микрошприца с контроллером насоса набрать в пипетку около 130 нанолитров диссоциационного раствора, обеспечивая при этом отсутствие пузырьков воздуха. Затем поместите интактные артериальные сегменты в один миллилитр диссоциационного раствора с необходимыми концентрациями ферментов в стеклянной пробирке объемом 10 миллилитров.

Инкубируйте при температуре 34 градуса Цельсия в течение 10-12 минут для частичного переваривания. После разложения замените ферментный раствор 5 миллилитрами свежего диссоциативного раствора. С помощью пипетки объемом 1 миллилитр перенесите один сегмент в камеру, содержащую раствор диссоциации комнатной температуры.

Затем поместите пипетку в диссоциационный раствор в камере и расположите ее близко к одному концу переваренного сосуда. Установите скорость в диапазоне от 2 до 5 нанолитров в секунду на контроллере насоса для мягкого растирания. При просмотре через увеличение от 100 до 200 раз извлекайте и выбрасывайте артериальный сегмент для диссоциации гладкомышечных клеток при образовании эндотелиальной трубки.

При необходимости осторожно с помощью щипцов с тонким наконечником отделяют диссоциированную адвентицию и внутреннюю эластическую пластинку от эндотелиальной трубки. Подтвердите, что все гладкомышечные клетки диссоциированы и что только эндотелиальные клетки остаются в виде неповрежденной трубки.

С помощью микроманипуляторов закрепите каждый конец эндотелиальной трубки на стеклянном покровном стеколе камеры суперфузии с помощью пипеток с боросиликатным стеклом. Вымойте диссоциированные адвентиции и гладкомышечные клетки из камеры, а раствор диссоциации замените двухмиллимолярным хлоридом кальция PSS.

Перенесите мобильную платформу, закрепленную на эндотелиальной трубке, на микроскоп суперфузионной и экспериментальной установки. Затем используйте шесть чистых резервуаров объемом 50 миллилитров для непрерывной подачи ПСС и соответствующих лекарственных растворов во время эксперимента.

Используйте встроенный клапан регулирования расхода, чтобы вручную установить скорость потока, постоянную, как ламинарный поток, при этом согласуя подачу потока с вакуумным всасыванием. Подайте PSS в камеру для суперфузии эндотелиальной трубки не менее чем за пять минут до записи фоновых данных и загрузки красителя.

Чтобы измерить мембранный потенциал одновременно с внутриклеточной концентрацией кальция, потяните за острый электрод и заполните его двумя молярами хлорида калия для записи из клеток, загруженных красителем Фура-2.

Для изучения межклеточного взаимодействия через перенос красителя необходимо заполнить микроэлектрод 0,1% йодидом пропидия, растворенным в двух молярах хлорида калия. Затем поместите электрод на серебряную проволоку, покрытую хлоридом, в держатель пипетки, прикрепленный к столику головки электрометра, закрепленному микроманипулятором.

С помощью микроманипулятора кратковременно поместите наконечник электрода в проточный PSS в камере, одновременно наблюдая за происходящим через объектив с четырехкратным увеличением. Затем установите потенциал мембраны покоя равным нулю в соответствии с потенциалом заземленной ванны.

При желании используйте звуковые базовые мониторы, подключенные к электрометрам, чтобы связать высоту звука с потенциальными записями. После этого увеличьте увеличение до 400 раз, используя объектив в 40 раз, и расположите кончик электрода прямо над клеткой эндотелиальной трубки.

Отрегулируйте фотометрическое окно с помощью программного обеспечения для фотометрии, чтобы сфокусироваться примерно на 50–80 эндотелиальных клетках. Затем аккуратно поместите электрод в одну из клеток эндотелиальной трубки с помощью микроманипулятора и подождите не менее двух минут, чтобы мембранный потенциал покоя стабилизировался.

Как только мембранный потенциал покоя стабилен на ожидаемом значении, включите фотоумножитель на флуоресцентном интерфейсе в отсутствие света и начните сбор внутриклеточной концентрации кальция, возбуждая Fura-2, попеременно, на 340 и 380 нанометрах и собирая флуоресцентное излучение на 510 нанометрах.

После того, как будут установлены одновременные измерения мембранного потенциала и внутриклеточной концентрации кальция, выделите около пяти минут на супер-слияние эндотелиальной трубки с ПСС при постоянной скорости ламинарного потока перед применением лекарственных препаратов.

Нанесите приготовленный в ПСС препарат в камеру суперфузии с постоянной скоростью потока. Во время лечения препаратом одновременно измеряйте мембранный потенциал в соотношении F340/F380. После завершения эксперимента извлеките электрод из ячейки. Затем прекратите соответствующие записи мембранного потенциала и внутриклеточной концентрации кальция и сохраните файлы для анализа данных.