Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 2:17 мин. • July 8th, 2025
Поместите покровную крышку, содержащую сокультуру, в записывающую камеру, перфузированную кислородосодержащим внеклеточным раствором.
Ко-культура состоит из астроцитов, нейронов коры головного мозга крыс, экспрессирующих светочувствительные ионные каналы, слитые с флуоресцентным белком, и нейронов, полученных из iPSC, экспрессирующих другой флуоресцентный белок.
С помощью конфокального микроскопа определите флуоресцентный нейрон, полученный из iPSC.
Продвигайте записывающую пипетку, наполненную внутриклеточным раствором, к нейрону, чтобы создать конфигурацию всей клетки.
Поддерживайте постоянный отрицательный потенциал мембраны для точных измерений тока.
Осветите сокультуру светом, чтобы активировать светочувствительные ионные каналы в корковых нейронах, тем самым генерируя потенциал действия.
Потенциал действия вызывает высвобождение нейромедиатора в синаптическую щель.
При синаптическом соединении нейротрансмиттеры связываются с рецепторами на нейроне, полученном из iPSC, открывая ионные каналы и генерируя постсинаптические токи.
Увеличение постсинаптических токов в нейронах, полученных из iPSC, после световой стимуляции подтверждает синаптические связи с корковыми нейронами.
Используйте конфокальный микроскоп, оснащенный 60-кратным водяным иммерсионным объективом. Перфузируйте клетки при комнатной температуре во внешнем растворе, постоянно пузырчатом с 95% кислорода, 5% углекислого газа. Используйте внутренний раствор для наполнения записывающей микропипетки.
Чтобы выполнить оптогенетическую стимуляцию, установите патч на tdTomato-положительную клетку в режиме цельной клетки и установите напряжение на отрицательные 70 милливольт. С помощью ртутной лампы для всего поля и фильтра возбуждения 480 на 40 стимулируйте все поле в течение 30 секунд. Записывайте постсинаптические токи, или ПСК, поврежденной клетки, индуцированные фотостимуляцией ChR2-экспрессирующих пресинаптических корковых нейронов.