Энциклопедия экспериментов JoVE
Нейронауки
0 просмотров • 3:18 мин. • July 8th, 2025
Начните со среза мозга крысы, содержащего целевую область нейрона, соединенную светочувствительным аксоном из другой области мозга.
Поместите срез в погружную камеру записи и закрепите его анкером для слайса.
Под микроскопом найдите нужный слой и определите целевой пирамидальный нейрон.
Поднимите объектив микроскопа, чтобы создать мениск с поверхностью среза.
Опустите в этот мениск стеклянную микропипетку, наполненную раствором для внутриклеточной записи.
Коснитесь кончиком пипетки идентифицированной пирамидальной ячейки, чтобы создать углубление в мембране.
Нанесите всасывание для образования уплотнения.
Увеличивайте всасывание до тех пор, пока мембрана не разорвется, создавая цельную конфигурацию клеток.
С помощью установленного источника света подайте световые импульсы на срез.
Эти световые импульсы запускают потенциал действия в светочувствительном аксоне, высвобождая нейротрансмиттеры в синаптической щели.
Запишите реакцию пирамидального нейрона на эти высвобождения, чтобы проанализировать синаптическую эффективность.
Для идентификации клетки-мишени поместите срез в записывающую камеру и иммобилизуйте его с помощью анкера для среза. При малом увеличении, используя инфракрасную подсветку, перейдите к слою LEC 5. Затем переключитесь на цель погружения в воду с большим увеличением и определите пирамидальные нейроны.
Отметьте положение ячейки на мониторе с помощью скотча. Затем для формирования целоклеточного зажима изготовьте микропипетку из боросиликатного стекла и заполните ее раствором для внутриклеточной записи. Поместите наполненную микропипетку в держатель электрода и надавите на мундштук, соединенный со боковым портом держателя электрода.
Поднимите объектив микроскопа так, чтобы образовался мениск, и вставьте электрод в мениск до тех пор, пока он не будет виден на микроскопе. Откройте окно для проверки герметичности и определите, составляет ли сопротивление пипетки от трех до пяти мегаом. Затем коснитесь идентифицированной клетки наконечником пипетки, в результате чего в клеточной мембране образуется углубление.
Затем приложите отрицательное давление путем всасывания к мундштуку, увеличивая сопротивление пипетки. Продолжайте постепенно оказывать отрицательное давление до тех пор, пока клеточная мембрана не разорвется, что приведет к переходным процессам емкости всей клетки. Чтобы войти в конфигурацию с токовым зажимом, используйте встроенный светодиод, направленный на световой путь микроскопа с фильтрующими кубами и соответствующей оптикой, и подайте световые импульсы на срез с помощью объектива 40x. Подавайте последовательности множественных световых импульсов с частотой 5 Гц, 10 Гц и 20 Гц для исследования свойств пресинаптического высвобождения.