Загрузка и разгрузка микроэлектродного FM-красителя в нервных клетках личинок дрозофилы

Начните с личинок дрозофилы, с обнаженных мышечных и нервных волокон, погруженных в раствор, содержащий везикулы флуоресцентного мембранного красителя, или FM-красителя.

FM-краситель связывается с липидами в клеточной мембране, образуя над ней флуоресцентное покрытие.

С помощью блока микроманипулятора расположите наконечник всасывающего микроэлектрода под микроскопом.

Сосредоточьтесь на нервных волокнах и микроэлектроде.

С помощью отрицательного давления всасывайте петлю нервного волокна в микроэлектрод.

Применяйте импульсы тока для стимуляции нервного волокна.

Это запускает нервно-мышечное соединение, где моторный нейрон соединяется с мышечным волокном, чтобы инициировать эндоцитоз синаптических везикул.

Во время этого процесса клетка поглощает мембрану, покрытую FM-красителем, образуя окрашенные эндоцитарные везикулы, идеально подходящие для визуализации пресинаптических стадий нейротрансмиссии.

Смойте краситель FM и замените наружный раствор.

Подайте импульсы тока, чтобы выгрузить из ячейки везикулы, окрашенные FM-красителем.

Для электростимуляции подготовьте отсасывающую пипетку с помощью съемника микроэлектродов, чтобы получить требуемый размер конуса и наконечника. После этого отполируйте наконечник микроэлектрода с помощью микрокузницы, чтобы обеспечить плотное прилегание при всасывании одного двигательного нерва.

Наденьте всасывающую пипетку на держатель электрода на микроманипуляторе, который прикреплен к длинной гибкой пластиковой трубке и шприцу. Далее поместите препарат с красителем FM на предметный столик микроскопа и поднимайте предметный столик до тех пор, пока личинка и всасывающая пипетка не окажутся в фокусе.

Затем всасывайте петлю перерезанного двигательного нерва, иннервируя выбранный полусегмент отрицательным давлением воздуха, создаваемым шприцем, в всасывающий электрод. Впоследствии стимулируйте двигательный нерв с использованием выбранных параметров для управления эндоцитозом SV и поглощением красителя FM1-43.

Наиболее важным шагом на этом этапе процедуры является втягивание одного аксона двигателя в всасывающий электрод с плотной посадкой. Для этого может потребоваться некоторое время проб и ошибок. После того, как будет найден подходящий аспирационный электрод, используйте его для всех сравниваемых условий, чтобы обеспечить постоянную силу стимуляции.

Для разгрузки красителя FM втяните тот же двигательный нерв в тот же электрод, а затем стимулируйте двигательный нерв для активации экзоцитоза SV и высвобождения красителя FM1-43.