Оптогенетическая электрофизиологическая регистрация клеток со светозависимыми ионными каналами
JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 3:54 мин • July 8th, 2025
Поместите покровное стекло, содержащее эмбриональные клетки почек, экспрессирующие светозависимые ионные каналы и флуоресцентный репортерный белок, на измерительную камеру с применением кремния. Закройте его и добавьте внешний буфер.
Расположите эту камеру под микроскопом. Поместите электрод для ванны, наполненный агаром. Перфуз с буфером для удаления остатков среды и омертвевших клеток.
С помощью флуоресцентного фильтра определите целевую клетку и сфокусируйтесь на ней.
Прикрепите к микроманипулятору патч-пипетку. Надавите, чтобы предотвратить засорение, и подойдите к камере.
Расположите пипетку рядом с клеткой и ослабьте положительное давление, чтобы на кончике образовался мембранный пластырь.
После формирования мембранного пятна приложите отрицательное давление, чтобы разорвать мембрану.
Подайте свет определенной длины волны, чтобы открыть ионные каналы. Движение ионов регистрируется как изменение напряжения электродом.
Для начала загерметизируйте измерительную камеру кремнием, чтобы предотвратить утечку внешнего буфера. Затем поместите одну покровную крышку в камеру и закройте ее. Осторожно заполните камеру внеклеточным буфером, чтобы предотвратить отслоение клеток. Затем поместите измерительную камеру под микроскоп с помощью объектива 40x для визуализации клеток.
Затем наденьте агаровый мост на электрод ванны и поместите его в камеру вместе с датчиком уровня жидкости и выходом перфузии обработчика ванны. Дважды замените внеклеточный раствор на 1 миллилитр свежего наружного раствора для удаления остатков питательной среды и оторвавшихся клеток. Сосредоточьтесь на клетках и найдите трансфицированную клетку, которую нужно изолировать от других клеток. Затем используйте набор трехполосных фильтров и оранжевый свет, чтобы возбудить и визуализировать mCherry.
Установите пипетку на держатель пипетки и надавите на нее, чтобы предотвратить засорение наконечника. Найдите кончик патч-пипетки под микроскопом и переместите его близко к клетке с помощью микроманипулятора.
В программном обеспечении для сбора данных запустите испытание мембраны в режиме ванны и примените шаг напряжения. Проверьте, находится ли сопротивление пипетки в нужном диапазоне от 1,3 до 3,0 мегаом. Затем обнулите токи смещения и отрегулируйте потенциал пипетки, повернув ручку смещения пипетки на усилителе.
Чтобы установить пластырь в конфигурации целой клетки, медленно приближайтесь к ячейке с помощью патч-пипетки сверху и ослабьте положительное давление непосредственно перед прикосновением к ячейке. Компенсируйте емкость пипетки, поворачивая ручку компенсации емкости пипетки, чтобы получить плоский отклик тестового импульса.
Переключите мембранный тест в режим Cell. Затем разорвите пластырь, не разрушая уплотнение, применяя короткие импульсы отрицательного давления или отрицательного давления с возрастающей силой, чтобы получить конформацию целой клетки.
Начните компенсацию последовательного сопротивления, установив два параметра всей ячейки: емкость ячейки и последовательное сопротивление. Регистрируйте светоиндуцированные токи при различных удерживающих потенциалах. На этом рисунке показано, что при освещении зеленым светом PSACR1 имеет быстрый переходный ток, который быстро затухает до стационарного уровня тока.
Обзор
В данной статье описывается метод регистрации светоиндуцированных ионных токов в эмбриональных клетках почек с использованием метода пэч-кламп. Процесс включает выделение трансфицированных клеток и воздействие светом определенной длины волны для активации ионных каналов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Электрофизиология
- Клеточная визуализация
- Методы нейронаук
Теоретические сведения
- Клетки эмбриональной почки могут быть генетически модифицированы для экспрессии светочувствительных ионных каналов.
- Методы локальной фиксации мембраны (patch-clamp) позволяют измерять ионные токи через клеточные мембраны.
- Флуоресцентные репортерные белки помогают визуализировать конкретные клетки в ходе экспериментов.
- Световая активация ионных каналов позволяет изучить клеточные ответы.
Цель исследования
- Разработать надежный метод регистрации ионных токов в ответ на световую стимуляцию.
- Продемонстрировать функциональность светозависимых ионных каналов в контролируемой среде.
- Представить подробный протокол для исследователей, заинтересованных в проведении аналогичных электрофизиологических исследований.
Используемые методы
- Подготовка покровных стекол с клетками эмбриональной почки.
- Использование измерительной камеры с силиконовым покрытием для предотвращения утечек.
- Применение метода патч-клампа для формирования мембранных участков.
- Регистрация изменений напряжения в ответ на световую стимуляцию.
Основные результаты
- Успешное формирование мембранных патчей на целевых клетках.
- Наблюдение светоиндуцированных токов при активации специфических ионных каналов.
- Характеристика переходных и стационарных уровней тока во время освещения.
- Валидация метода для последующих электрофизиологических исследований.
Выводы
- Описанный метод позволяет эффективно регистрировать индуцированные светом ионные токи.
- Данную методику можно применять к различным типам клеток, экспрессирующих светочувствительные каналы.
- Дальнейшие исследования могут расширить области применения этого метода в нейробиологических исследованиях.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Оптогенетическая электрофизиология позволяет точно исследовать функции ионных каналов в живых клетках, что способствует валидации мишеней в нейробиологии и фармакологии. Связывая световую стимуляцию с измеримыми электрофизиологическими показателями, данный метод обеспечивает получение количественных данных для снижения рисков при изучении механизмов действия модуляторов ионных каналов. Такой подход повышает прогностическую достоверность на ранних этапах разработки за счет обеспечения воспроизводимой, контролируемой светом оценки селективности и кинетики каналов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает функциональную валидацию светозависимых ионных каналов в качестве терапевтических мишеней посредством прямого измерения ионного потока.
- Практическая ценность: предоставляет воспроизводимую систему для оценки селективности и кинетики каналов при контролируемой световой стимуляции.
- Стратегическая ценность: позволяет проводить гипотетический скрининг соединений, модулирующих активность каналов в физиологически релевантном контексте.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать количественные измерения тока, индуцированного светом, которые пригодны для разработки анализов и скрининга соединений.
- Эксплуатационная ценность: обеспечивает стандартизированный электрофизиологический метод регистрации активности ионных каналов с высокой временной точностью.
- Стратегическая ценность: позволяет в режиме реального времени контролировать влияние соединений на функцию каналов, повышая эффективность валидации хитов.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: облегчает характеристику мутантов или вариантов ионных каналов, имеющих значение при заболеваниях, в контролируемой клеточной системе.
- Практическая ценность: обеспечивает доклиническое профилирование модуляторов ионных каналов с использованием масштабируемой светоактивируемой платформы.
- Стратегическая ценность: повышает трансляционную преемственность, связывая электрофизиологию in vitro с оптогенетическими моделями in vivo.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска лекарственных средств, предоставляя электрофизиологический анализ с оптическим контролем для характеристики ионных каналов, что способствует идентификации соединений-лидеров посредством функциональной валидации.
- Фундаментальная биология: позволяет проверять гипотезы о функционировании ионных каналов посредством светозависимой активации и измерения тока.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные электрофизиологические данные для оценки влияния соединений на активность каналов.
- Аналитика: позволяет регистрировать изменения напряжения для сравнения ионных потоков при различных условиях и интенсивности света.
- Трансляционные исследования: способствуют доклинической оценке рисков за счет функционального сравнения каналов дикого типа и мутантных каналов.
- Корпоративное использование: создает многоразовую платформу для профилирования ионных каналов по нескольким мишеням и сериям соединений.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает достоверность валидации мишени за счет прямого, управляемого светом измерения функции ионных каналов.
- Операционная ценность: повышает воспроизводимость и стандартизацию анализа благодаря оптогенетическому контролю активации каналов.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения механистической неопределенности в эффективности модуляторов ионных каналов.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритезацию мишеней ионных каналов с учетом рисков на основе валидированных электрофизиологических профилей.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы в области электрофизиологии методом патч-кламп и использования оптогенетических инструментов.
- Метод зависит от наличия флуоресцентной микроскопии и систем подачи света для активации каналов.
- Необходима стабильная экспрессия светозависимых ионных каналов и флуоресцентных репортеров в клетках-хозяевах.
- Требуется оптимизация длины волны и интенсивности света для предотвращения фототоксичности при обеспечении активации каналов.
- Необходим тщательный контроль условий окружающей среды для поддержания жизнеспособности клеток во время длительных сеансов регистрации.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Optogenetic Стимуляция слухового нерва
Похожие видео
0 Просмотры
Оптогенетика Функциональная МРТ
Похожие видео
0 Просмотры
Всего-клеточные Recordings Света Вызванные Возбуждающие Synaptic токи в сетчатке глаза фрагмент
Похожие видео
0 Просмотры
Электрофизиологические характеристика GFP-выражая клеточных популяций в Неповрежденный Retina
Похожие видео
0 Просмотры
Оптогенетическая стимуляция и электрофизиологическая регистрация синаптических событий в срезах мозга крыс
Похожие видео
0 Просмотры
Метод высокой верности Optogenetic управление отдельными пирамидальных нейронов
Похожие видео
0 Просмотры
Руководство по В естественных условиях Регистрация отдельных единиц из Optogenetically Идентифицировано корковых ингибиторной интернейронов
Похожие видео
0 Просмотры
Регистрация цельноклеточных патч-фиксаторов для электрофизиологического определения селективности ионов в канале-каналодопсинах
Похожие видео
0 Просмотры
Метод Optogenetic для контроля и анализа картин выражения гена в ячейке для взаимодействия
Похожие видео
0 Просмотры
Оптогенетика идентификация типа нейронов с Optrode стекла в бодрствовать мышей
Похожие видео
0 Просмотры
Последнее обновление: 29 августа 2026