Перфорированные патч-зажимы для записи тел сенсорных нейронов внутреннего уха

Поместите культуру тел сенсорных нейронов внутреннего уха в камеру для записи.

Предварительно заполните пипетку с патч-хомутом внутренним раствором.

Засыпьте этим же раствором, содержащим мембранно-перфорирующий антибиотик, позволяющий ему постепенно достигать кончика.

Заполните две трети пипетки раствором антибиотика, вставьте его в держатель, содержащий записывающий электрод, и опустите в камеру.

Визуализируйте под микроскопом приближение к нейрону.

Когда кончик пипетки контактирует с нейроном, поверхность нейронов образует ямочку, и сопротивление увеличивается.

Приложите отрицательное давление, чтобы образовалось плотное уплотнение между пипеткой и мембраной.

Поддерживайте удерживающий потенциал, близкий к потенциалу мембраны покоя.

Антибиотик перфорирует мембрану, позволяя ионному движению между клеткой и электродом создавать стабильную ионную среду.

Подавайте ступени напряжения на открытые потенциал-зависимые ионные каналы, обеспечивая приток ионов и генерацию токов, пропорциональных функции ионного канала, которые регистрируются электродом.

Опустите кончик пипетки в чистый раствор питательной чашки, чтобы заполнить ее чистым раствором, не содержащим амфотерицина. Заполните заднюю часть пипетки внутренним раствором, содержащим амфотерицин. Опустите кончик пипетки обратно в чистый раствор чашки для культивирования, в то время как амфотерицин медленно входит в наконечник с обратной стороны пипетки. Далее закончите заполнение пипетки раствором амфотерицина до 2/3 пипетки.

Опустите пипетку в ванну записывающей камеры и найдите наконечник пипетки в центре поля зрения. Убедитесь, что на наконечнике нет пузырьков воздуха или другого мусора. Расположите пипетку близко к мембране и плотно приземлитесь на центр клетки. Надавите отрицательно или отсосите с помощью шприца или пипетки.

Включите удерживающий потенциал минус 60 милливольт. Сопротивление уплотнения должно увеличиваться до тех пор, пока оно не пройдет гигаом. Как только образуется гигаомное уплотнение, сбросьте отрицательное давление. Начинает действовать амфотерицин. Входное сопротивление медленно уменьшается, а ток, протекающий в ответ на шаг напряжения 5 милливольт, постепенно увеличивается по мере того, как амфотерицин проникает в мембрану.