Запись нейронных связей в острых срезах мозга с помощью парного пластыря

Закрепите срез мозга с целевой областью в записывающей камере.

Поместите записывающую пипетку, содержащую внутренний раствор, над постсинаптическим нейроном и получите конфигурацию всей клетки.

Введите пипетку для поиска пластыря рядом с пресинаптическим нейроном.

Эта пипетка заполнена раствором на основе натрия для предотвращения деполяризации нейронов во время поиска пресинаптической клетки.

Используйте мягкое отсасывание, чтобы установить конфигурацию с неплотным уплотнением с помощью ищущей пипетки.

Удерживайте мембранный потенциал и подавайте большие импульсы тока, чтобы запустить потенциал действия в пресинаптическом нейроне.

Следите за постсинаптической реакцией на эту стимуляцию.

Если реакция не обнаружена, подключите другой пресинаптический нейрон и повторите стимуляцию.

Продолжайте этот процесс до тех пор, пока в постсинаптическом нейроне не будет наблюдаться ответная реакция.

Замените ищущую пипетку на записывающую пипетку и установите конфигурацию всей клетки в пресинаптическом нейроне.

Подавайте импульсы тока, чтобы вызвать потенциалы действия в пресинаптическом нейроне и записать постсинаптический ответ.

После подготовки срезов целевого региона дайте им инкубироваться. За это время вытяните пластырь пипетки, которые должны иметь длинный и тонкий хвостовик. Закрепив срез мозга платиновой арфой в экспериментальной камере, наполните записывающую пипетку внутренним раствором.

Поместите пипетку в предусилитель и подключите предполагаемый постсинаптический нейрон в режиме цельной клетки. Используя поисковую патч-пипетку с сопротивлением от 8 до 10 МГм, заполненную внутренним раствором, в котором соли калия заменены солями натрия, мягко отсасывайте к поисковой пипетке, чтобы запатировать потенциальный пресинаптический нейрон в конфигурации с прикрепленными свободными ячейками.

Удерживайте потенциал мембраны под ослабленным уплотнением в диапазоне от отрицательных 30 до отрицательных 60 милливольт в режиме зажима тока. Затем подайте большие импульсы тока от 0,2 до 2 наноампер, чтобы вызвать потенциал действия в потенциальной пресинаптической клетке.

Наблюдайте за этим потенциалом действия в виде небольшого всплеска, загорающегося на реакции напряжения. Установите частоту стимуляции на 0,1 Гц, чтобы предотвратить истощение постсинаптического ответа. Если постсинаптический нейрон не реагирует на стимуляцию испытуемого потенциально пресинаптического нейрона, заплатите новый потенциальный пресинаптический нейрон в режиме свободного уплотнения.

Протестируйте таким образом до 30 потенциально пресинаптических нейронов, продолжая использовать один и тот же поисковый патч-электрод до тех пор, пока не будет установлено уплотнение с сопротивлением более 30 мегаом.

Если стимуляция в режиме свободного уплотнения приводит к EPSP или IPSP с задержкой менее пяти миллисекунд в постсинаптическом нейроне, удалите ищущую пипетку из пресинаптического нейрона.

С помощью записывающего патч-электрода заполняют биоцитином, содержащим обычный внутренний раствор с сопротивлением от четырех до восьми мегаом, патчируют пресинаптический нейрон и записывают в целую клетку ток в режиме зажима. Вызывайте потенциалы действия путем инжекции тока в пресинаптические нейроны и регистрируйте постсинаптический ответ.