Оценка ленточных синапсов в определенных частотных областях улитки мыши

Начните с пробирок, содержащих предварительно обработанные улитковые витки мыши с проникающим агентом и блокатором, которые предотвращают неспецифические взаимодействия.

Каждый поворот обнаруживает разные звуковые частоты и содержит волосковые клетки, которые преобразуют звук в электрические сигналы. Эти сигналы передаются через нейротрансмиттеры в ленточных синапсах к слуховому нерву.

Удалите раствор и добавьте первичные антитела, которые взаимодействуют с белками в волосах и нервных клетках в ленточных синапсах, затем промойте.

Инкубируйте с вторичными антителами, помеченными красными и зелеными флуорофорами, которые связываются с их первичными антителами.

Промойте, чтобы удалить несвязанные вторичные антитела.

Поместите образец на предметное стекло с монтажной средой, содержащей ядерный краситель для окрашивания ядер в синий цвет.

Установите покровное стекло. Высушите его, затем с помощью конфокального микроскопа получите изображение каждого сегмента на разной глубине.

Ленточные синапсы выглядят как близко расположенные красные и зеленые точки.

Подсчитайте эти функциональные точки в каждом повороте, чтобы соотнести их реакцию с частотой звука.

После вскрытия поместите каждый поворот улитки в отдельные 2,5-миллилитровые центрифужные пробирки. Блокируйте любое неспецифическое связывание с помощью 10% козьей сыворотки в PBS в 0,1% Triton X-100 на 1 час при комнатной температуре на ротаторе.

В конце инкубации используйте наконечник для пипетки объемом 200 микролитров, чтобы удалить раствор под микроскопом для препарирования. Инкубируйте образцы с первичными антителами, которые представляют интерес, разведенными в 5% козьей сыворотке в PBS и 0,1% Triton X-100 в течение ночи при 4 градусах Цельсия на ротаторе.

На следующее утро промойте образцы тканей три раза в течение 5 минут холодным 0,1 моляра PBS на промывку, чтобы удалить любые остаточные первичные антитела. Затем пометьте образцы соответствующими вторичными антителами, разведенными в 5% козьей сыворотке в PBS и 0,1% Triton X-100 в течение двух-трех часов при комнатной температуре на ротаторе, защищенном от света.

В конце инкубации образцы трижды промывают 0,1 молярного PBS, как показано на рисунке, и переносят образцы в отдельные 35-миллиметровые планшеты, содержащие 0,1 молярного PBS. Поместите каплю монтажного материала, дополненного DAPI, на предметное стекло и перенесите образцы из PBS в монтажный материал. Положите по одному краю покровного стекла на каждое предметное стекло и отпустите, чтобы покровные стекла мягко опустились. Затем высушите предметные стекла в слайд-боксе при температуре 4 градуса Цельсия на ночь.

Для получения изображений образцов используйте конфокальный микроскоп с соответствующими лазерами и масляную иммерсионную линзу с 63-кратным разрешением. Для получения 8-микрометровых конфокальных z-стеков от каждого поворота улитки. Для подсчета синаптических точек установите z-стеки с шагом 0,3 микрометра так, чтобы они охватывали всю длину внутренних волосковых клеток, гарантируя, что все синаптические точки могут быть визуализированы, и объедините изображения, содержащие пункты, в стопку для получения проекции по оси Z.

Импортируйте объединенные изображения в соответствующую программу обработки изображений. Разделите общее количество синаптических точек в каждом z-стеке в определенных частотных областях на количество DAPI-положительных внутренних волосковых клеток, чтобы рассчитать количество синаптических точек для каждой клетки. В каждой конкретной частотной области усредните все синаптические точки в 3 изображениях различных микроскопических полей, содержащих от 9 до 11 внутренних волосковых клеток.

Чтобы лучше визуализировать архитектуру цитоскелета и синаптическую локализацию, используйте инструмент «Щетка» для визуальной оценки синаптической структуры и распределения отдельных внутренних волосковых клеток. Чтобы проверить сопоставление пресинаптических лент и постсинаптических рецепторных патчей, используйте инструмент «Прямоугольная область» для извлечения воксельного пространства вокруг лент и используйте обрезку изображений, чтобы изолировать отдельные ленты. Затем нажмите «Изображение» и «Размер изображения», чтобы получить массив миниатюр этих миниатюрных проекций, который можно использовать для идентификации парных синапсов и бесхозных лент.