Why use cold conditions during protein extraction?

Cold conditions help preserve protein integrity by reducing enzymatic activity and preventing degradation during lysis.

How does protease inhibition improve protein extraction reliability?

Protease inhibitors block cellular proteolytic enzymes, protecting target proteins from degradation and ensuring accurate downstream analysis.

What role does mechanical homogenization play in cell lysis?

Mechanical homogenization ensures complete cell disruption and efficient protein release following detergent-mediated membrane permeabilization.

Why is repeated washing with cold phosphate buffer necessary?

Repeated washing removes residual culture medium that could interfere with lysis buffer efficiency and contaminate protein samples.

What enables downstream analysis of extracted proteins?

The protocol yields a protein-rich supernatant suitable for quantification and detection in assays such as Western blotting or ELISA.

Экстракция белка из нейрональных клеток

JoVE Encyclopedia of Experiments

Нейронауки

0 просмотров • 1:58 мин • July 8th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возьмите культуру клеток, содержащую раковые клетки нейронов, прикрепленную к покровному стеколу, и поддерживайте ее в холодных условиях.

Удалите питательную среду и многократно промойте клетки холодным фосфатным буфером для удаления остаточной среды.

Добавьте буфер для лизиса, содержащий низкую концентрацию неионогенного детергента и ингибиторов протеазы.

Неионогенное детергентное средство разрушает клеточную мембрану, инициируя лизис.

Между тем, ингибиторы протеазы блокируют клеточные протеолитические ферменты, защищая белки от ферментативной деградации.

Затем с помощью скребка для клеток вытесните частично лизированные клетки из покровного стекла.

Перенесите содержимое в пробирку, содержащую буфер для лизиса.

В холодных условиях используйте гомогенизатор для механического лизирования клеток, обеспечивая полный лизис клеток и высвобождение белка.

Центрифугируйте лизат клеток.

Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку.

Извлеченные белки из опухолевых клеток нейронов теперь готовы к дальнейшему анализу.

Для подтверждения экспрессии белка через 48 часов после трансфекции поместите чашки для культивирования на лед и промойте клетки два раза PBS. Обработайте клетки в каждой чашке от 200 до 400 микролитров буфера для лизиса и используйте скребок для удаления клеток из покровных стекол.

Перенесите отделенные клетки с каждой пластины в отдельные микроцентрифужные пробирки, а затем диссоциируйте клетки с помощью гомогенизатора подо льдом. Через одну минуту оденьте гомогенизированные кусочки клеток методом центрифугирования.