Экстракция белка из нейрональных клеток

Возьмите культуру клеток, содержащую раковые клетки нейронов, прикрепленную к покровному стеколу, и поддерживайте ее в холодных условиях.

Удалите питательную среду и многократно промойте клетки холодным фосфатным буфером для удаления остаточной среды.

Добавьте буфер для лизиса, содержащий низкую концентрацию неионогенного детергента и ингибиторов протеазы.

Неионогенное детергентное средство разрушает клеточную мембрану, инициируя лизис.

Между тем, ингибиторы протеазы блокируют клеточные протеолитические ферменты, защищая белки от ферментативной деградации.

Затем с помощью скребка для клеток вытесните частично лизированные клетки из покровного стекла.

Перенесите содержимое в пробирку, содержащую буфер для лизиса.

В холодных условиях используйте гомогенизатор для механического лизирования клеток, обеспечивая полный лизис клеток и высвобождение белка.

Центрифугируйте лизат клеток.

Соберите надосадочную жидкость в свежую пробирку.

Извлеченные белки из опухолевых клеток нейронов теперь готовы к дальнейшему анализу.

Для подтверждения экспрессии белка через 48 часов после трансфекции поместите чашки для культивирования на лед и промойте клетки два раза PBS. Обработайте клетки в каждой чашке от 200 до 400 микролитров буфера для лизиса и используйте скребок для удаления клеток из покровных стекол.

Перенесите отделенные клетки с каждой пластины в отдельные микроцентрифужные пробирки, а затем диссоциируйте клетки с помощью гомогенизатора подо льдом. Через одну минуту оденьте гомогенизированные кусочки клеток методом центрифугирования.