Выделение белков клеточной поверхности и внутриклеточных белков из культуры астроцитов

Возьмите культуру астроцитов и удалите среду. Добавьте физиологический буфер и инкубируйте на льду, подавляя эндоцитоз белков клеточной поверхности.

Инкубируйте с реагентом для биотинилирования, который связывает белки клеточной поверхности.

Затем инкубируйте с буфером для гашения, чтобы инактивировать любой непрореагировавший реагент.

Добавьте холодный физиологический буфер и механически отделите клетки. Пересадите клетки, затем центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Инкубируйте с буфером для лизиса для лизиса клеток, высвобождая биотинилированные белки клеточной поверхности и небиотинилированные внутриклеточные белки.

Центрифугуем, собираем надосадочную жидкость, и отделяем фракцию с общим содержанием белка.

Оставшуюся фракцию инкубируйте при перемешивании с гранулами, покрытыми стрептавидином, которые связывают биотинилированные белки.

Прядите вниз связанные с белками гранулы клеточной поверхности и отделите надосадочную жидкость, содержащую внутриклеточные белки.

Промойте шарики при перемешивании, чтобы удалить неспецифически связанные белки, затем центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, изолируя белки клеточной поверхности.

Фракции, содержащие общие, вну