Выделение белков клеточной поверхности и внутриклеточных белков из культуры астроцитов

Возьмите культуру астроцитов и удалите среду. Добавьте физиологический буфер и инкубируйте на льду, подавляя эндоцитоз белков клеточной поверхности.

Инкубируйте с реагентом для биотинилирования, который связывает белки клеточной поверхности.

Затем инкубируйте с буфером для гашения, чтобы инактивировать любой непрореагировавший реагент.

Добавьте холодный физиологический буфер и механически отделите клетки. Пересадите клетки, затем центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость.

Инкубируйте с буфером для лизиса для лизиса клеток, высвобождая биотинилированные белки клеточной поверхности и небиотинилированные внутриклеточные белки.

Центрифугуем, собираем надосадочную жидкость, и отделяем фракцию с общим содержанием белка.

Оставшуюся фракцию инкубируйте при перемешивании с гранулами, покрытыми стрептавидином, которые связывают биотинилированные белки.

Прядите вниз связанные с белками гранулы клеточной поверхности и отделите надосадочную жидкость, содержащую внутриклеточные белки.

Промойте шарики при перемешивании, чтобы удалить неспецифически связанные белки, затем центрифугируйте и выбросьте надосадочную жидкость, изолируя белки клеточной поверхности.

Фракции, содержащие общие, внутриклеточные и поверхностные белки, готовы к анализу.

Чтобы начать эту процедуру, извлеките культуры астроцитов из инкубатора и выбросьте среду путем аспирации. Вымойте клетки трижды 4 миллилитрами охлажденного CM-PBS, а посуду поставьте на колотый лед.

Извлеките CM-PBS методом аспирации, а затем пипеткой внесите по два миллилитра биотинового буфера в каждую лунку. Осторожно наклоните посуду вперед и назад несколько раз, чтобы обеспечить полное покрытие, прежде чем поместить культуры на лед на 30 минут.

После этого удалите биотиновый буфер, замените его четырьмя миллилитрами буфера для гашения и подержите культуры на льду в течение 10 минут. Далее отсадите и замените таким же количеством буфер для гашения, прежде чем оставить культуры на льду на 10 минут.

Затем выбросьте буфер для гашения и трижды промойте клетки 4 миллилитрами охлажденного CM-PBS. После этого соскребите клетки в один миллилитр охлажденного CM-PBS и перенесите суспензию в микроцентрифужную пробирку.

Затем гранулируйте клетки центрифугированием при 100 г в течение трех минут в охлаждаемой микроцентрифуге, установленной на 4 градуса Цельсия. После этого выбросьте надосадочную жидкость, и повторно суспендируйте клетки в 500 микролитрах буфера для лизиса.

Затем оставьте образцы на льду на 30 минут, переворачивая каждые пять минут. После этого центрифугируйте лизат при 14 000 г в течение 10 минут при 4 градусах Цельсия, чтобы гранулировать любые моющие средства и растворимые материалы. Затем перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку. Сохраните 50 микролитров лизата и добавьте в него 25 микролитров 3-кратного загрузочного буфера.

Впоследствии денатурируйте его, нагрев до 95 градусов Цельсия в сухой бане. Это входная фракция, содержащая как биотинилированные белки клеточной поверхности, так и небиотинилированные цитозольные белки. С помощью отрезанного наконечника пипетки перенесите в лизат 75 микролитров агарозных шариков стрептавидина и выдержите его при температуре 4 градуса Цельсия в течение трех часов на шейкере.

После этого гранулируйте стрептавидина агарозными шариками центрифугированием при 1500 г в течение 30 секунд при четырех градусах Цельсия. Сохраните 50 микролитров надосадочной жидкости и добавьте 25 микролитров 3x загрузочного буфера. Затем денатурируйте его при температуре 95 градусов Цельсия на водяной бане или в нагревательном блоке. Он представляет собой внутриклеточную фракцию и состоит в основном из небиотинилированных цитозольных белков.

После этого снова суспензируйте гранулированные шарики в одном миллилитре буфера для промывки и покачивайте его в течение трех минут при температуре 4 градуса Цельсия. Гранулируйте шарики, а надосадочную жидкость выбросьте. Повторите этот процесс еще четыре раза, чтобы свести к минимуму неспецифическое связывание небиотинилированных цитозольных белков.

Добавьте 50 микролитров загрузочного буфера, разбавленного в 1 раз с помощью буфера для лизиса. Высвободите биотин и стрептавидин из гранул, денатурировав их при 95 градусах Цельсия. Эта фракция должна содержать только биотинилированные белки клеточной поверхности.