Оценка притягательной или отталкивающей активности белков с помощью нейронов гиппокампа

Начните с чашки, содержащей кремниевую матрицу, которая имеет несколько небольших каналов, подключенных к входным и выходным портам.

Введите тестируемый белок с отталкивающей активностью через входное отверстие для заполнения каналов.

Инкубируйте, чтобы обеспечить прилипание белка в области канала, формируя тестовые белковые зоны, затем промойте.

Снимите матрицу, наложите на покрытый участок контрольный белок, обладающий привлекательной активностью, и инкубируйте.

Это облегчает прилипание контрольного белка к пустым участкам между зонами тестируемого белка, создавая зоны контрольного белка с чередующимся полосатым рисунком, а затем промывая.

Добавьте ламинин для покрытия полосатого участка, затем постирайте.

Засейте покрытый участок одноклеточной суспензией нейронов гиппокампа и инкубируйте.

В тестовой белковой зоне нейроны взаимодействуют с белками, запуская сигналы, которые заставляют нейроны отталкиваться, подавляя их прикрепление.

Напротив, нейрон-белковые взаимодействия в зоне контрольного белка способствуют прикреплению нейронов, поддерживая их рост и удлинение аксонов.

Приготовьте флуоресцентно меченные рекомбинантные белки в PBS. Сделайте по 25 микролитров на каждое полосатое блюдо. Дайте смеси понервироваться при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее для каждой посуды загрузите в шприц 22-го калибра 25 микролитров разбавленного белка и введите его через небольшое отверстие сбоку матрицы.

Избегайте введения пузырьков воздуха в матрицы, так как они нарушат связывание ваших белков с болезнью.

Теперь инкубируйте чашки в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе для клеточных культур. После инкубации внесите по 300 микролитров PBS в верхнюю щель каждой матрицы. Затем отсасывайте PBS из небольшого отверстия, расположенного сбоку от каждой матрицы, чтобы удалить все неприсоединившиеся рекомбинантные белки. Не делайте полную аспирацию PBS, потому что белки высохнут.

Выполняйте такое полоскание PBS в общей сложности три раза. Далее аккуратно снимите матрицу с каждой посуды. Затем сразу же добавьте около 100 микролитров контрольного белка на всю полосатую область, создавая поочередное покрытие на каждом блюде.

Далее инкубируйте посуду в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Тем временем на льду разморозьте ламинин в PBS в дозе 20 микрограмм на миллилитр. Через 30 минут трижды вымойте посуду с помощью PBS. Затем смажьте каждую посуду примерно 100 микролитрами холодного ламинина и верните посуду в инкубатор еще на час.

Через час используйте PBS, чтобы снова вымыть посуду три раза. После третьего мытья добавьте в каждую посуду около 150 микролитров питательной среды. Затем инкубируйте чашки в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, пока они не понадобятся. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и воспроизведите 10 000 нейронов в 150 микролитрах питательных сред на каждой подготовленной полосовой пластине. Аккуратно отложите суспензию так, чтобы она покрыла всю область полосы.