Выделение амилоидных фибрилл из экстракта мозговой ткани

Примите экстракт ткани мозга мыши, содержащий неамилоидные белки и амилоидные фибриллы, нерастворимый белковый агрегат.

Добавьте твердую сахарозу и перемешайте, увеличивая плотность раствора.

Перенесите его и центрифугируйте для отделения более плотных белков от мусора.

Выбросьте надосадочную жидкость, повторно суспендируйте гранулу в буфере с более высокой концентрацией сахарозы, перемешайте и центрифугируйте.

Соберите верхний слой, содержащий несколько амилоидных фибрилл, в свежую пробирку, добавьте буфер для промывки и перемешайте.

Теперь выбросьте средний слой и перенесите обогащенную амилоидными фибриллами гранулу в пробирку, содержащую фракцию верхнего слоя, для максимальной изоляции.

Центрифугируйте объединенные фракции и выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте буфер для пищеварения и инкубируйте для расщепления исключительно неамилоидных белков.

Центрифугируйте и удалите надосадочную жидкость. Промойте гранулы, чтобы удалить остатки переваренных белков.

Ресуспендируйте гранулу в солюбилизационном буфере на основе сахарозы, содержащем моющее средство, которое солюбилизирует оставшиеся неамилоидные белки.

Центрифугу, удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте выделенные амилоидные фибриллы.

Начните с помещения только что препарированной или замороженной области мозговой ткани в двухмиллилитровую пробирку, содержащую от шести до восьми керамических шариков и свежеприготовленный ледяной гомогенизационный буфер. Затем измельчите ткань с помощью гомогенизатора бисерной мельницы со скоростью 4000 об/мин с двумя циклами по 30 секунд при включении и выключении импульса. Теперь добавьте девять миллилитров ледяного гомогенизационного буфера к одному миллилитру гомогената мозговой ткани в 15-миллилитровой пробирке и запечатайте лабораторными полосками из восковой пленки.

Чтобы обеспечить надежную солюбилизацию, держите трубку вращающейся в течение ночи при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день добавьте в суспензию тканевого экстракта твердую сахарозу до конечной концентрации 1,2 моля. Хорошо перемешайте и центрифугируйте при 250 000 раз больше г в течение 45 минут при температуре 4 градуса Цельсия. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в двух миллилитрах гомогенизационного буфера, содержащего 1,9 молярной сахарозы, путем растирания и центрифугируйте при 125 000 умноженных на g в течение 45 минут при 4 градусах Цельсия.

После центрифугирования переложите верхний белый твердый слой в свежую пробирку и растворите в 1 миллилитре ледяного буфера для промывки, пипетируя вверх и вниз несколько раз. Поскольку гранула также обогащена амилоидными фибриллами, выбросьте водный средний слой и соедините гранулу с верхним слоем для получения более высокого выхода. Центрифугируйте объединенные фракции при 8000 умноженных на г в течение 20 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

После удаления надосадочной жидкости повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитр ледяного буфера для пищеварения, и инкубируйте при комнатной температуре в течение трех часов на вихре. Снова центрифугируйте образец, затем дважды промойте гранулу в 1 миллилитре ледяного буфера Tris и снова центрифугируйте. После второй промывки повторно суспендируйте гранулу в 1 миллилитре солюбилизационного буфера путем пипетирования вверх и вниз и быстро центрифугируйте пробирку при 200 000 раз больше g в течение 60 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

Сохраните гранулу, затем уменьшите концентрацию сахарозы с 1,3 до 1 моляра, добавив в надосадочную жидкость 50 миллимолярного буфера Tris. Снова центрифугируйте надосадочную жидкость, затем растворите обе гранулы в 100 микролитрах буфера Tris, содержащего 0,5% SDS. Для очистки амилоида солюбилизируйте богатые амилоидом гранулы с помощью ультразвуковых волн в устройстве для ультразвуковой обработки в ванне в течение 20 циклов. Затем немедленно центрифугируйте материал при 20 000 умноженных на g в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия.

Суспендируйте гранулу в 500 микролитрах 0,5% буфера SDS Tris, и повторите промывку еще четыре раза. После заключительного этапа центрифугирования промойте гранулу в 200 микролитрах сверхчистой воды и центрифугируйте при 20 000 г в течение 30 минут при температуре 4 градуса Цельсия, чтобы удалить остатки моющего средства. Растворите конечную гранулу, содержащую очищенные амилоидные фибриллы, в 100 микролитрах сверхчистой воды.