Оценка интернейронного ответа на хемопривлекательные сигналы от перивентрикулярных эндотелиальных клеток

Закрепите трехкамерный культуральный вкладыш в чашке с полимерным покрытием для прикрепления клеток.

Переверните тарелку, отметьте среднее отделение и переориентируйте ее. Добавьте в этот отсек среду, содержащую интернейроны.

Добавьте среду, содержащую перивентрикулярные эндотелиальные клетки человека, или PVECs, клетки сосудов головного мозга, в один из внешних компартментов.

В другой внешний отсек добавьте среду, содержащую неперивентрикулярные эндотелиальные клетки в качестве контроля.

Добавьте в чашку сокультуральную среду, чтобы предотвратить высыхание полимера. Инкубируйте для адгезии клеток.

Разберите вкладыш, создав прямоугольные участки ячеек с небольшими безклеоточными промежутками между каждым типом клеток.

Освежите с помощью среды для совместной культуры и инкубируйте.

Эндотелиальные клетки заставляют интернейроны мигрировать в свободные от клеток пространства.

Между тем, PVEC высвобождают химические аттрактанты, которые усиливают миграцию интернейронов к пятну, содержащему PVEC.

Более высокая миграция интернейронов к участку PVEC, чем к участку контрольной клетки, подтверждает реакцию интернейрона на хемопривлекательные сигналы от PVEC.

Для проведения хемоаттракционного анализа поместите трехлуночный культуральный вкладыш в центр 35-миллиметровой чашки, покрытой поли-L-орнитином и ламинином. Переверните тарелку вверх дном, и отметьте границу вокруг среднего отделения вкладыша с помощью перманентного маркера с ультратонким наконечником.

Засейте 30 000 ГАМКергических интернейронов в 70 микролитрах нейронной среды в среднем отделе. Затем засейте 10 000 перивентрикулярных эндотелиальных клеток и 10 000 контрольных эндотелиальных клеток в 70 микролитрах соответствующей среды в двух внешних компартментах.

Добавьте 1 миллилитр сокультуральной среды вдоль стенки посуды, чтобы предотвратить высыхание покрытия на блюде. Через 48 часов извлеките вкладыш и инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа в течение 36 часов.