JoVE Encyclopedia of Experiments
Нейронауки
0 просмотров • 2:55 мин • July 8th, 2025
Начните с пробирки, содержащей предварительно обработанные магнитные шарики, покрытые антителами, специфичными к белку-мишени, сшитому с ДНК.
Добавьте лизат моторного нейрона, содержащий фрагменты ДНК, и инкубируйте с перемешиванием.
Фрагменты ДНК взаимодействуют с гранулами, покрытыми антителами, образуя комплексы бисер-ДНК.
Центрифуга собирает жидкость из колпачка и помещает ее на магнитный сепаратор для осаждения комплексов бусина-ДНК.
Удалите надосадочную жидкость, содержащую несвязанные фрагменты ДНК.
Введите буфер для лизиса на основе детергента для солюбилизации неспецифически связанных фрагментов ДНК.
Центрифугируйте и выполните магнитную сепарацию, затем удалите надосадочную жидкость.
Мойте с буфером с высоким содержанием соли, чтобы нарушить неспецифические взаимодействия. Центрифугуем, проводим магнитную сепарацию и удаляем надосадочную жидкость.
Промойте буфером LiCl, чтобы удалить оставшиеся неспецифические взаимодействия. Центрифугуем, проводим магнитную сепарацию и удаляем надосадочную жидкость.
Наконец, промойте с помощью буфера Tris-HCl, центрифугируйте и выполните магнитную сепарацию.
Удалите надосадочную жидкость и соберите шарики, содержащие целевые комплексы белок-ДНК.
Чтобы начать иммунопреципитацию хроматина, промойте покрытые антителами шарики в 1 миллилитре блокирующего раствора. Поместите пробирку с шариками, покрытыми антителами, на качающуюся платформу при температуре 4 градуса Цельсия на 5 минут. После непродолжительного вращения поместите трубку на магнитную решетку, и удалите надосадочную жидкость.
Суспендируйте покрытые антителами гранулы в 50 микролитрах блокирующего раствора. Добавьте 1 миллилитр лизатов ультразвука к гранулам, покрытым антителами. Затем инкубируйте образец на качающейся платформе при температуре 4 градуса Цельсия на ночь. Дав образцу инкубироваться в течение ночи, соберите жидкость с крышки, кратковременно вращая пробирку. Затем поместите пробирку на магнитный штатив, а через 1 минуту осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
Далее выполните серию стирок следующим образом. Добавьте в образец 1 миллилитр буфера для холодной стирки, содержащего CPI. Перемешивайте образец на качающейся платформе при температуре 4 градуса Цельсия в течение 5 минут. Кратковременно поверните пробирку с образцом. Затем поместите на магнитную решетку. Через 1 минуту удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.