Разработка in vitro модели инфекции, вызванной вирусом Зика, в органоидах головного мозга

Возьмем многолуночный планшет, содержащий органоиды головного мозга человека в среде нейронной индукции.

Органоиды содержат стволовые клетки, радиальные глиальные клетки, нейральные клетки-предшественники или NPC, а также нейроны, расположенные в радиальном узоре, называемом розеткой, имитируя развивающийся мозг.

Удалите среду и промойте органоиды с помощью буфера.

Добавьте вирус Зика, взвешенный в буфере, в тестовые лунки и только буфер в контрольные лунки.

Инкубируются, позволяя вирусу связываться со своими рецепторами на NPC и усваиваться.

Вымойте для удаления неинтернализованных вирусов, затем добавьте свежую среду для нервной индукции и инкубируйте.

Интернализованные вирусы используют механизмы клетки-хозяина для образования новых вирусных частиц.

Размножение вирусов вызывает реакцию клеточного стресса, которая вызывает апоптоз, уменьшая количество NPC, доступных для развития органоидов.

Со временем инфицированные органоиды демонстрируют уменьшение размера и нарушение морфологии, что отражает аномальное развитие мозга у людей, инфицированных вирусом Зика.

Доведите 1X Balanced Salt Solution, 1X PBS и среду Neural Induction от Earle до 37 градусов Цельсия в водяной бане. Затем разведите вирус Зика известной концентрации в растворе 1X Earle's до целевой кратности инфекции, которая обычно составляет от 0,1 до 10. С помощью пипетки P200 тщательно удалите всю среду из каждой лунки органоида, затем быстро промойте органоиды 200 микролитрами теплой 1X PBS.

При извлечении среды из каждой лунки крайне важно не прикасаться к органоиду и не всасывать его в пипетку. Это может нанести непоправимый ущерб органоиду. Если это произойдет, лучше всего выбросить органоид.

Далее аккуратно удалите всю оставшуюся жидкость из каждой органоидной лунки с помощью одноканальной пипетки P200. Затем быстро добавьте в каждую лунку 50 микролитров либо 1x раствора Earle's для имитации инфекции, либо раствора вируса Зика. Убедитесь, что каждый органоид полностью погружен в воду. Когда закончите, поместите пластину обратно в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на два часа.

После того, как вирусный контакт завершен. Промойте каждую лунку от органоидов 200 микролитрами PBS. Дайте органоидам осесть в течение 15 секунд, а затем извлеките PBS с помощью одноканальной пипетки P200. Наконец, добавьте 200 микролитров свежей среды для нервной индукции в каждую лунку и поместите тарелку обратно в инкубатор.