Оценка жизнеспособности нейронов в культуре нейронов мозжечка с помощью двойного окрашивания

Начните с культурального планшета, обработанного антимитотическим агентом, который подавляет рост глиальных клеток, оставляя в основном гранулярные нейроны мозжечка и небольшое количество глиальных клеток.

Удалите среду и медленно добавьте холодный фосфатно-солевой буфер или PBS для поддержания жизнеспособности клеток.

Замените буфер смесью для холодного окрашивания и инкубируйте.

Эта смесь содержит флуоресцеина диацетат или FDA, нефлуоресцентное соединение, и йодид пропидия или PI, непроницаемый для мембран флуоресцентный краситель.

FDA диффундирует в клетки, где функциональная эстераза в живых клетках превращает ее в зеленое флуоресцентное соединение.

ПИ проникает в мертвые клетки через поврежденные мембраны, связывается с ДНК и излучает красную флуоресценцию.

Удалите раствор для окрашивания и добавьте холодный PBS, чтобы предотвратить высыхание клеток.

Получение флуоресцентных изображений для окрашивания FDA и PI и фазово-контрастного изображения. Объедините изображения FDA и PI.

Затем сравните это флуоресцентное изображение с фазово-контрастным изображением, которое помогает исключить большие глиальные клетки.

Красная флуоресценция указывает на гибель нейронов, в то время как з