Оценка жизнеспособности нейронов в культуре нейронов мозжечка с помощью двойного окрашивания

Начните с культурального планшета, обработанного антимитотическим агентом, который подавляет рост глиальных клеток, оставляя в основном гранулярные нейроны мозжечка и небольшое количество глиальных клеток.

Удалите среду и медленно добавьте холодный фосфатно-солевой буфер или PBS для поддержания жизнеспособности клеток.

Замените буфер смесью для холодного окрашивания и инкубируйте.

Эта смесь содержит флуоресцеина диацетат или FDA, нефлуоресцентное соединение, и йодид пропидия или PI, непроницаемый для мембран флуоресцентный краситель.

FDA диффундирует в клетки, где функциональная эстераза в живых клетках превращает ее в зеленое флуоресцентное соединение.

ПИ проникает в мертвые клетки через поврежденные мембраны, связывается с ДНК и излучает красную флуоресценцию.

Удалите раствор для окрашивания и добавьте холодный PBS, чтобы предотвратить высыхание клеток.

Получение флуоресцентных изображений для окрашивания FDA и PI и фазово-контрастного изображения. Объедините изображения FDA и PI.

Затем сравните это флуоресцентное изображение с фазово-контрастным изображением, которое помогает исключить большие глиальные клетки.

Красная флуоресценция указывает на гибель нейронов, в то время как зеленая флуоресценция указывает на жизнеспособность нейронов.

Начните окрашивание с смешивания диацетата флуоресцеина до конечной концентрации 10 микрограммов на миллилитр и йодида пропидиума до конечной концентрации 50 микрограммов на миллилитр в 10 миллилитрах PBS. Смешайте раствор FDA PI путем вортекса и положите на лед. Положите тарелку с культурой на лед.

Осторожно отсасывайте питательную среду, не касаясь клеток наконечником пипетки. Затем медленно добавляйте холодные PBS. Отсадите PBS, затем добавьте холодный рабочий раствор FDA PI или FDA PI Hoechst. Поставьте тарелку на лед на пять минут. Далее, после аспирации рабочего раствора FDA PI или FDA PI Hoechst, добавьте холодный PBS в каждую лунку.

Убедитесь, что флуоресцентный микроскоп настроен правильно. Определите флуоресцентное излучение для FDA PI и Hoechst на 520, 620 и 460 нанометров соответственно, используя время воздействия от 100 до 300 миллисекунд и аналоговое усиление в 2,8 раза. После сбора флуоресцентных изображений сделайте снимок при нормальном освещении в режиме фазового контраста.

Для двойного окрашивания FDA PI наложите изображения клеток, перетащив положительный слой FDA поверх положительного слоя PI в программном обеспечении для редактирования графики. Отрегулируйте непрозрачность FDA-положительного слоя, введя 50% в поле непрозрачности панели Слоёв. Объедините два слоя, открыв меню Слой и нажав на кнопку Объединить видимые. Установите контрастность наложенных изображений, введя 50 в поле контрастности в разделе Изображение, Коррекция, Яркость/Контрастность. Убедитесь, что на наложенных изображениях нет двойных положительных клеток FDA и PI.

Для тройного окрашивания FDA PI Hoechst наложите изображения клеток, опять же, перетащив FDA-положительный слой на PI-положительный слой, отрегулировав непрозрачность FDA-положительного слоя и объединив изображения, как и раньше. Затем перетащите положительный слой Хёхста на объединённый слой.

Отрегулируйте непрозрачность положительного слоя Хёхста, введя 50% в поле непрозрачности панели Слоёв, и объедините два слоя, открыв меню Слой и нажав на кнопку Объединить видимый. Визуально отличайте большие, неправильные глиальные клетки от зернистых нейронов мозжечка, сравнивая изображения, сделанные в флуоресцентном режиме, с изображениями, полученными в режиме фазового контраста.